華渤文,趙錦芳,王金華,肖子康,趙 筱
(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430068)
琥珀酸(succinic acid),又稱丁二酸,作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中[1]。琥珀酸是工業(yè)上一種重要的四碳化合物,廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆和塑料等行業(yè)[2]。同時(shí),作為直鏈飽和二元羧酸,可以比較容易的合成大量的化學(xué)物質(zhì),如1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)類(lèi)生物可降解材料,被美國(guó)能源部認(rèn)為是未來(lái)12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一[3]。目前,大部分工業(yè)上琥珀酸的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成方法,但是用化學(xué)合成方法得到琥珀酸,需要消耗大量不可再生的化石原料,并且具有轉(zhuǎn)化率低,易污染環(huán)境等弊端。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸由于其利用可再生資源,原料來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉,污染小,并且在發(fā)酵過(guò)程中固定CO2[4],具有很好的應(yīng)用前景,成為近些年的研究熱點(diǎn)。琥珀酸的生產(chǎn)菌株很多,目前主要集中在琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)[5]、琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)[6-7]、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens)[8]和重組大腸桿菌(Escherichia coli)[9]。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易進(jìn)行代謝調(diào)控、操作簡(jiǎn)便和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)被廣泛用于研究構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的工程菌株[10]。目前,利用廉價(jià)的可再生物質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸受到許多研究者的親睞,Liu等[11]利用Actinobacillus succinogenes CGMCC1593以經(jīng)過(guò)預(yù)處理的甘蔗糖蜜作為原料,搖瓶厭氧發(fā)酵后琥珀酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為50.6g/L和0.84g/(L·h),分批發(fā)酵得到更高的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度,分別為55.2g/L和1.15g/(L·h)。Agarwal等[12]利用甘蔗糖蜜和玉米漿作原料,大腸桿菌在搖瓶發(fā)酵36h積累琥珀酸7.1g/L,在發(fā)酵罐中通過(guò)控制發(fā)酵液的pH以及持續(xù)通入CO2,30h后積累琥珀酸17g/L。Wang等[13]構(gòu)建了重組菌株Escherichia coli SD121,利用玉米秸稈水解液采取兩階段發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸,最終產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為57.81g/L和0.87,這是首次報(bào)道大腸桿菌工程菌利用玉米秸稈水解液產(chǎn)琥珀酸,并且從玉米秸稈高轉(zhuǎn)化得到琥珀酸,展示了大腸桿菌利用可再生的生物質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的強(qiáng)大潛力。葡萄糖結(jié)晶廢糖液和玉米漿是玉米加工廠的副產(chǎn)物,具有廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn),本研究以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的高產(chǎn)琥珀酸工程菌Escherichia coli WS100為研究對(duì)象,考察其在玉米漿培養(yǎng)基和NBS培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性,為高效、低成本琥珀酸工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
E.coli WS100 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建得到;葡萄糖結(jié)晶廢糖液(以下簡(jiǎn)稱廢糖液)、玉米漿 某玉米淀粉產(chǎn)葡萄糖加工廠,廢糖液的糖濃度為500g/L(全部為葡萄糖),玉米漿含氮為1%,含乳酸11.76g/L;琥珀酸、乳酸、乙酸、甲酸的標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自Sigma公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;種子培養(yǎng)基 NBS培養(yǎng)基[14]加2%葡萄糖;發(fā)酵培養(yǎng)基 NBS培養(yǎng)基((NH4)2HPO3作為氮源,添加葡萄糖作為碳源)和玉米漿培養(yǎng)基(玉米漿作為氮源,添加廢糖液作為碳源以及WB生長(zhǎng)促進(jìn)劑),初始糖濃度均為60g/L。
超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫?fù)u床、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;移液器 德國(guó)Eppendorf公司;7L發(fā)酵罐 Sartorius Stedim,Biotech GmbH 37070,Gottingen Germany;高效液相色譜儀 美國(guó)戴安公司。
1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng):從平板挑取單菌落至裝有200mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,置于37℃搖床,200r/min培養(yǎng)22h。
分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以5%的接種量接入裝有4L培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中,初始葡萄糖濃度為60g/L。整個(gè)過(guò)程37℃恒溫厭氧發(fā)酵,攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min,通過(guò)自動(dòng)流加3mol/L KOH和1.5mol/L K2CO3的混合溶液控制pH維持在7.0左右。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)料2次,每次補(bǔ)加30g/L的葡萄糖溶液(或廢糖液),累計(jì)補(bǔ)加120g/L葡萄糖(或廢糖液)。
1.2.2 生物量的檢測(cè) 生物量以600nm處的吸光度來(lái)表示(OD600)。采用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定菌體細(xì)胞在600nm波長(zhǎng)下的吸光值OD600,稀釋相應(yīng)倍數(shù),使測(cè)得的OD值在0.8以下。
1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析 發(fā)酵液中的葡萄糖和有機(jī)酸的測(cè)定采用高效液相色譜法。高效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000反相HPLC,色譜柱為Bio-Rad HPX 87H,VWD-3100雙光束可變波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)檢測(cè)器;流動(dòng)相:4mmol/L H2SO4(pH2.5);流速:0.5mL/min;進(jìn)樣量:20μL;紫外檢測(cè)器檢測(cè),柱溫:35℃。
琥珀酸的質(zhì)量收率定義為:每消耗1g葡萄糖所能產(chǎn)生的琥珀酸的克數(shù);琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為每升發(fā)酵罐有效裝液量每小時(shí)產(chǎn)琥珀酸的克數(shù);糖利用率定義為消耗的糖占初始糖的百分比。
由圖1可以看出,在厭氧條件下,菌體生長(zhǎng)非常迅速,4h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,23h時(shí)菌體濃度達(dá)到最大,OD600為7.63。菌體在35h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期,OD值保持在5~6之間。在耗糖方面,由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期,前8h耗糖速度比較緩慢;8~23h,菌體消耗葡萄糖的速率持續(xù)增大,反映了菌體能很好地利用葡萄糖生長(zhǎng),為大量發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸創(chuàng)造了優(yōu)越的條件,發(fā)酵過(guò)程采用分批補(bǔ)加葡萄糖,兩次分別補(bǔ)加30g/L的葡萄糖(發(fā)酵液中葡萄糖濃度)溶液,控制葡萄糖濃度在50g/L以下,整個(gè)過(guò)程累計(jì)添加葡萄糖120g/L,菌體在83h內(nèi)消耗葡萄糖110.30g/L,耗糖速率為1.33g/(L·h)。
圖1 WS100在無(wú)機(jī)鹽基中的發(fā)酵特性Fig.1 Fermentation of WS100 in NBS medium
發(fā)酵液中初糖濃度為60g/L,在開(kāi)始階段,菌體密度小,葡萄糖消耗少,菌體的產(chǎn)物也很少,菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,葡萄糖消耗的速率增大,琥珀酸不斷積累,到達(dá)穩(wěn)定期后,大量的菌體發(fā)酵積累琥珀酸,如圖1所示,發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為琥珀酸,有少量乙酸、甲酸和乳酸生成,分批補(bǔ)料發(fā)酵83h,琥珀酸的產(chǎn)量為84.98g/L,琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度為1.02g/(L·h),其他副產(chǎn)物乙酸為9.34g/L,甲酸為3.62g/L,乳酸僅為0.86g/L,整個(gè)發(fā)酵過(guò)程,琥珀酸的質(zhì)量收率為77.04%。
發(fā)酵液初始葡萄糖濃度同樣為60g/L,以玉米漿作為氮源,玉米漿濃度為20g/L,從圖2中可以看出,菌體發(fā)酵初始階段消耗葡萄糖的速率大,這是因?yàn)橛衩诐{中含有許多有機(jī)氮源,營(yíng)養(yǎng)豐富,有利于菌體生長(zhǎng)繁殖,因此使得發(fā)酵液中菌體濃度大,消耗葡萄糖的量多。發(fā)酵過(guò)程采用分批補(bǔ)加廢糖液,兩次分別補(bǔ)加含30g/L葡萄糖(發(fā)酵液中葡萄糖濃度)的廢糖液,控制葡萄糖濃度在50g/L以下,83h內(nèi)累計(jì)添加含120g/L葡萄糖(發(fā)酵液中葡萄糖濃度)的廢糖液,整個(gè)厭氧發(fā)酵過(guò)程菌體耗糖量和耗糖速率分別為96.17g/L和1.16g/(L·h)。如圖2所示,發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為琥珀酸,含有少量的乳酸和乙酸,無(wú)甲酸產(chǎn)生。發(fā)酵83h時(shí),發(fā)酵液中琥珀酸的產(chǎn)量為63.45g/L,琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率分別為0.76g/(L·h)和65.98%,其他雜酸:乙酸為2.96g/L,乳酸積累9.36g/L,由于玉米漿中含有乳酸,初始培養(yǎng)基中乳酸濃度為4.02g/L,所以菌體產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)量為5.34g/L。
圖2 WS100在玉米漿培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性Fig.2 Fermentation of WS100 in corn steep liquor medium
由表1可以看出,0~12h,菌體在玉米漿培養(yǎng)基中消耗葡萄糖的速率明顯大于在NBS培養(yǎng)基中的,在玉米漿培養(yǎng)基中,菌體消耗20.64g/L葡萄糖,而在NBS培養(yǎng)基中,菌體僅消耗9.65g/L葡萄糖,菌體在玉米漿培養(yǎng)基中的耗糖速率是在NBS培養(yǎng)基中的2.15倍。12h之后,菌體在玉米漿培養(yǎng)基中消耗葡萄糖量小于在NBS培養(yǎng)基中的,在添加相同濃度葡萄糖的情況下,發(fā)酵83h時(shí),NBS培養(yǎng)基中殘?zhí)橇績(jī)H為9.7g/L,而玉米漿培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇繛?3.83g/L。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,菌體在NBS培養(yǎng)基耗糖速率為1.33g/(L·h),在玉米漿培養(yǎng)基中為1.16g/(L·h)。
菌體在兩種培養(yǎng)基中的發(fā)酵主要產(chǎn)物均為琥珀酸,但是琥珀酸的積累不同,如表1所示,前12h,菌體在NBS培養(yǎng)基中積累琥珀酸8.41g/L,在玉米漿培養(yǎng)基中卻能積累琥珀酸15.42g/L。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中(0~83h),菌體在NBS培養(yǎng)基中琥珀酸的產(chǎn)量比在玉米漿中多21.53g/L,表明NBS培養(yǎng)基比玉米漿培養(yǎng)基更有利于菌體發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸,乙酸在玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵液中的產(chǎn)量比在NBS培養(yǎng)基中少6.38g/L,玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵液中乳酸的產(chǎn)量比在NBS培養(yǎng)基中多4.48g/L,NBS培養(yǎng)基發(fā)酵液中甲酸的產(chǎn)量為3.62g/L,而玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵液中沒(méi)有甲酸積累。發(fā)酵產(chǎn)物均為HPLC檢測(cè),液相圖譜如圖3所示,圖3(A)為NBS培養(yǎng)基83h發(fā)酵液的出峰情況,圖3(B)為玉米漿培養(yǎng)基83h發(fā)酵液的出峰情況。
圖3 發(fā)酵液的HPLC圖譜分析Fig.3 HPLC profiles analysis of fermentation products
本研究對(duì)Escherichia coli WS100分別在NBS培養(yǎng)基和玉米漿培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),表明玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液可以發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸,琥珀酸產(chǎn)量為63.45g/L,琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率分別為0.76g/(L·h)和65.98%,在NBS培養(yǎng)基中琥珀酸的產(chǎn)量更高,達(dá)到84.98g/L,另外琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率都優(yōu)于在玉米漿培養(yǎng)基中的,分別為1.02g/(L·h)和77.04%。
表1 WS100在不同培養(yǎng)基中耗糖情況和發(fā)酵產(chǎn)物的比較Table 1 Comparison of consumption of sugar and products by WS100 in different medium
盡管如此,本研究中WS100在玉米漿培養(yǎng)基中積累琥珀酸的產(chǎn)量在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平。本實(shí)驗(yàn)采用分批補(bǔ)料發(fā)酵的操作方式,較好地避免了糖濃度過(guò)高對(duì)菌體的抑制作用,提高了WS100發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的效率。實(shí)驗(yàn)采用的玉米漿和廢糖液是一種廉價(jià)的可再生的原料,更能夠顯著體現(xiàn)發(fā)酵可以不與人爭(zhēng)糧、不與人爭(zhēng)地的優(yōu)點(diǎn),是一種有工業(yè)應(yīng)用前景的琥珀酸發(fā)酵的原料。本實(shí)驗(yàn)室今后的研究著重于培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化,增加WS100在玉米漿培養(yǎng)基中積累琥珀酸的產(chǎn)量,降低琥珀酸的生產(chǎn)成本,使廉價(jià)的玉米漿和廢糖液能代替無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖制備琥珀酸成為可能。
[1]奚永蘭,陳可泉,李建,等.琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中固定CO2的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2010(7):1314-1319.
[2]周彬,華渤文,周勝德,等.琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技,2012,48(3):18-21.
[3]Willke T,Vorlop KD.Industrial bioconversion of renewable resources as an alternative to conventional chemistry[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,66(2):131-142.
[4]Song H,Lee SY.Production of succinic acid by bacterial fermentation[J].Enzyme and Microbial Technology,2006,39(3):352-361.
[5]Davis C,Cleven D,Brown J,et al.Anaerobiospirillum,a new genus of spiral-shaped bacteria[J].International journalof systematic bacteriology,1976,26(4):498-504.
[6]林日輝,黃新林,黃文勤.高產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的誘變選育[J].食品工業(yè)科技,2012,33(7):161-164.
[7]Guettler MV,Rumler D,Jain MK.Actinobacillus succinogenes sp.nov.,a novel succinic acid-producing strain from the bovine rumen [J].International journal of systematic bacteriology,1999,49(1):207-216.
[8]Lee P,Lee S,Hong S,et al.Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium,Mannheimia succiniciproducens MBEL55E,from bovine rumen[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002,58(5):663-668.
[9]Clark DP.The fermentation pathways of Escherichia coli[J].FEMS Microbiology Letters,1989,63(3):223-234.
[10]Wu H,Li Z,Zhou L,et al.Improved succinic acid production in the anaerobic culture of an Escherichia coli pflB ldhA double mutant as a result of enhanced anaplerotic activities in the preceding aerobic culture[J].Applied and environmental microbiology,2007,73(24):7837-7843.
[11]Liu YP,Zheng P,Sun ZH,et al.Economical succinic acid production from cane molasses by Actinobacillus succinogenes[J].Bioresource technology,2008,99(6):1736-1742.
[12]Agarwal L,Isar J,Meghwanshi G,et al.A cost effective fermentative production of succinic acid from cane molasses and corn steep liquor by Escherichia coli[J].Journal of applied microbiology,2006,100(6):1348-1354.
[13]Wang D LQ,Yang MH,Zhang YJ,et al.Efficient production of succinic acid from corn stalk hydrolysates by a recombinant Escherichia coli with ptsG mutation[J].Process Biochem,2011,46(1):365-371.
[14]Causey T,Zhou S,Shanmugam K,et al.Engineering the metabolism of Escherichia coli W3110 for the conversion of sugar to redox-neutral and oxidized products:homoacetate production[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(3):825-832.