重組大腸桿菌利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的研究

華渤文，趙錦芳，王金華，肖子康，趙 筱

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實驗室，湖北武漢430068）

琥珀酸（succinic acid），又稱丁二酸，作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中[1]。琥珀酸是工業(yè)上一種重要的四碳化合物，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆和塑料等行業(yè)[2]。同時，作為直鏈飽和二元羧酸，可以比較容易的合成大量的化學(xué)物質(zhì)，如1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚琥珀酸丁二醇酯（PBS）類生物可降解材料，被美國能源部認(rèn)為是未來12種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一[3]。目前，大部分工業(yè)上琥珀酸的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成方法，但是用化學(xué)合成方法得到琥珀酸，需要消耗大量不可再生的化石原料，并且具有轉(zhuǎn)化率低，易污染環(huán)境等弊端。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸由于其利用可再生資源，原料來源廣泛，價格低廉，污染小，并且在發(fā)酵過程中固定CO2[4]，具有很好的應(yīng)用前景，成為近些年的研究熱點(diǎn)。琥珀酸的生產(chǎn)菌株很多，目前主要集中在琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）[5]、琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）[6-7]、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）[8]和重組大腸桿菌（Escherichia coli）[9]。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易進(jìn)行代謝調(diào)控、操作簡便和生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的工程菌株[10]。目前，利用廉價的可再生物質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸受到許多研究者的親睞，Liu等[11]利用Actinobacillus succinogenes CGMCC1593以經(jīng)過預(yù)處理的甘蔗糖蜜作為原料，搖瓶厭氧發(fā)酵后琥珀酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為50.6g/L和0.84g/（L·h），分批發(fā)酵得到更高的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，分別為55.2g/L和1.15g/（L·h）。Agarwal等[12]利用甘蔗糖蜜和玉米漿作原料，大腸桿菌在搖瓶發(fā)酵36h積累琥珀酸7.1g/L，在發(fā)酵罐中通過控制發(fā)酵液的pH以及持續(xù)通入CO2，30h后積累琥珀酸17g/L。Wang等[13]構(gòu)建了重組菌株Escherichia coli SD121，利用玉米秸稈水解液采取兩階段發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，最終產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為57.81g/L和0.87，這是首次報道大腸桿菌工程菌利用玉米秸稈水解液產(chǎn)琥珀酸，并且從玉米秸稈高轉(zhuǎn)化得到琥珀酸，展示了大腸桿菌利用可再生的生物質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的強(qiáng)大潛力。葡萄糖結(jié)晶廢糖液和玉米漿是玉米加工廠的副產(chǎn)物，具有廉價的優(yōu)點(diǎn)，本研究以本實驗室構(gòu)建的高產(chǎn)琥珀酸工程菌Escherichia coli WS100為研究對象，考察其在玉米漿培養(yǎng)基和NBS培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性，為高效、低成本琥珀酸工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coli WS100 由本實驗室構(gòu)建得到；葡萄糖結(jié)晶廢糖液（以下簡稱廢糖液）、玉米漿 某玉米淀粉產(chǎn)葡萄糖加工廠，廢糖液的糖濃度為500g/L（全部為葡萄糖），玉米漿含氮為1%，含乳酸11.76g/L；琥珀酸、乳酸、乙酸、甲酸的標(biāo)準(zhǔn)品 購自Sigma公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純或生化試劑，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；種子培養(yǎng)基 NBS培養(yǎng)基[14]加2%葡萄糖；發(fā)酵培養(yǎng)基 NBS培養(yǎng)基（（NH4）2HPO3作為氮源，添加葡萄糖作為碳源）和玉米漿培養(yǎng)基（玉米漿作為氮源，添加廢糖液作為碳源以及WB生長促進(jìn)劑），初始糖濃度均為60g/L。

超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫?fù)u床、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；移液器 德國Eppendorf公司；7L發(fā)酵罐 Sartorius Stedim，Biotech GmbH 37070，Gottingen Germany；高效液相色譜儀 美國戴安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：從平板挑取單菌落至裝有200mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于37℃搖床，200r/min培養(yǎng)22h。

分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以5%的接種量接入裝有4L培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，初始葡萄糖濃度為60g/L。整個過程37℃恒溫厭氧發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，通過自動流加3mol/L KOH和1.5mol/L K2CO3的混合溶液控制pH維持在7.0左右。發(fā)酵過程中補(bǔ)料2次，每次補(bǔ)加30g/L的葡萄糖溶液（或廢糖液），累計補(bǔ)加120g/L葡萄糖（或廢糖液）。

1.2.2 生物量的檢測 生物量以600nm處的吸光度來表示（OD600）。采用可見分光光度計測定菌體細(xì)胞在600nm波長下的吸光值OD600，稀釋相應(yīng)倍數(shù)，使測得的OD值在0.8以下。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析 發(fā)酵液中的葡萄糖和有機(jī)酸的測定采用高效液相色譜法。高效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000反相HPLC，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，VWD-3100雙光束可變波長紫外可見檢測器；流動相：4mmol/L H2SO4（pH2.5）；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：20μL；紫外檢測器檢測，柱溫：35℃。

琥珀酸的質(zhì)量收率定義為：每消耗1g葡萄糖所能產(chǎn)生的琥珀酸的克數(shù)；琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為每升發(fā)酵罐有效裝液量每小時產(chǎn)琥珀酸的克數(shù)；糖利用率定義為消耗的糖占初始糖的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.coli WS100在NBS培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性

由圖1可以看出，在厭氧條件下，菌體生長非常迅速，4h進(jìn)入對數(shù)生長期，23h時菌體濃度達(dá)到最大，OD600為7.63。菌體在35h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，OD值保持在5～6之間。在耗糖方面，由于在對數(shù)生長初期，前8h耗糖速度比較緩慢；8～23h，菌體消耗葡萄糖的速率持續(xù)增大，反映了菌體能很好地利用葡萄糖生長，為大量發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸創(chuàng)造了優(yōu)越的條件，發(fā)酵過程采用分批補(bǔ)加葡萄糖，兩次分別補(bǔ)加30g/L的葡萄糖（發(fā)酵液中葡萄糖濃度）溶液，控制葡萄糖濃度在50g/L以下，整個過程累計添加葡萄糖120g/L，菌體在83h內(nèi)消耗葡萄糖110.30g/L，耗糖速率為1.33g/（L·h）。

圖1 WS100在無機(jī)鹽基中的發(fā)酵特性Fig.1 Fermentation of WS100 in NBS medium

發(fā)酵液中初糖濃度為60g/L，在開始階段，菌體密度小，葡萄糖消耗少，菌體的產(chǎn)物也很少，菌體進(jìn)入對數(shù)生長期后，葡萄糖消耗的速率增大，琥珀酸不斷積累，到達(dá)穩(wěn)定期后，大量的菌體發(fā)酵積累琥珀酸，如圖1所示，發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為琥珀酸，有少量乙酸、甲酸和乳酸生成，分批補(bǔ)料發(fā)酵83h，琥珀酸的產(chǎn)量為84.98g/L，琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度為1.02g/（L·h），其他副產(chǎn)物乙酸為9.34g/L，甲酸為3.62g/L，乳酸僅為0.86g/L，整個發(fā)酵過程，琥珀酸的質(zhì)量收率為77.04%。

2.2 E.coli WS100在玉米漿培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性

發(fā)酵液初始葡萄糖濃度同樣為60g/L，以玉米漿作為氮源，玉米漿濃度為20g/L，從圖2中可以看出，菌體發(fā)酵初始階段消耗葡萄糖的速率大，這是因為玉米漿中含有許多有機(jī)氮源，營養(yǎng)豐富，有利于菌體生長繁殖，因此使得發(fā)酵液中菌體濃度大，消耗葡萄糖的量多。發(fā)酵過程采用分批補(bǔ)加廢糖液，兩次分別補(bǔ)加含30g/L葡萄糖（發(fā)酵液中葡萄糖濃度）的廢糖液，控制葡萄糖濃度在50g/L以下，83h內(nèi)累計添加含120g/L葡萄糖（發(fā)酵液中葡萄糖濃度）的廢糖液，整個厭氧發(fā)酵過程菌體耗糖量和耗糖速率分別為96.17g/L和1.16g/（L·h）。如圖2所示，發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為琥珀酸，含有少量的乳酸和乙酸，無甲酸產(chǎn)生。發(fā)酵83h時，發(fā)酵液中琥珀酸的產(chǎn)量為63.45g/L，琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率分別為0.76g/（L·h）和65.98%，其他雜酸：乙酸為2.96g/L，乳酸積累9.36g/L，由于玉米漿中含有乳酸，初始培養(yǎng)基中乳酸濃度為4.02g/L，所以菌體產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)量為5.34g/L。

圖2 WS100在玉米漿培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性Fig.2 Fermentation of WS100 in corn steep liquor medium

2.3 E.coli WS100在兩種培養(yǎng)基中發(fā)酵情況的比較

由表1可以看出，0～12h，菌體在玉米漿培養(yǎng)基中消耗葡萄糖的速率明顯大于在NBS培養(yǎng)基中的，在玉米漿培養(yǎng)基中，菌體消耗20.64g/L葡萄糖，而在NBS培養(yǎng)基中，菌體僅消耗9.65g/L葡萄糖，菌體在玉米漿培養(yǎng)基中的耗糖速率是在NBS培養(yǎng)基中的2.15倍。12h之后，菌體在玉米漿培養(yǎng)基中消耗葡萄糖量小于在NBS培養(yǎng)基中的，在添加相同濃度葡萄糖的情況下，發(fā)酵83h時，NBS培養(yǎng)基中殘?zhí)橇績H為9.7g/L，而玉米漿培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇繛?3.83g/L。整個發(fā)酵過程中，菌體在NBS培養(yǎng)基耗糖速率為1.33g/（L·h），在玉米漿培養(yǎng)基中為1.16g/（L·h）。

菌體在兩種培養(yǎng)基中的發(fā)酵主要產(chǎn)物均為琥珀酸，但是琥珀酸的積累不同，如表1所示，前12h，菌體在NBS培養(yǎng)基中積累琥珀酸8.41g/L，在玉米漿培養(yǎng)基中卻能積累琥珀酸15.42g/L。整個發(fā)酵過程中（0～83h），菌體在NBS培養(yǎng)基中琥珀酸的產(chǎn)量比在玉米漿中多21.53g/L，表明NBS培養(yǎng)基比玉米漿培養(yǎng)基更有利于菌體發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，乙酸在玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵液中的產(chǎn)量比在NBS培養(yǎng)基中少6.38g/L，玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵液中乳酸的產(chǎn)量比在NBS培養(yǎng)基中多4.48g/L，NBS培養(yǎng)基發(fā)酵液中甲酸的產(chǎn)量為3.62g/L，而玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵液中沒有甲酸積累。發(fā)酵產(chǎn)物均為HPLC檢測，液相圖譜如圖3所示，圖3（A）為NBS培養(yǎng)基83h發(fā)酵液的出峰情況，圖3（B）為玉米漿培養(yǎng)基83h發(fā)酵液的出峰情況。

圖3 發(fā)酵液的HPLC圖譜分析Fig.3 HPLC profiles analysis of fermentation products

3 結(jié)論

本研究對Escherichia coli WS100分別在NBS培養(yǎng)基和玉米漿培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實驗，表明玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液可以發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸產(chǎn)量為63.45g/L，琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率分別為0.76g/（L·h）和65.98%，在NBS培養(yǎng)基中琥珀酸的產(chǎn)量更高，達(dá)到84.98g/L，另外琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率都優(yōu)于在玉米漿培養(yǎng)基中的，分別為1.02g/（L·h）和77.04%。

表1 WS100在不同培養(yǎng)基中耗糖情況和發(fā)酵產(chǎn)物的比較Table 1 Comparison of consumption of sugar and products by WS100 in different medium

盡管如此，本研究中WS100在玉米漿培養(yǎng)基中積累琥珀酸的產(chǎn)量在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平。本實驗采用分批補(bǔ)料發(fā)酵的操作方式，較好地避免了糖濃度過高對菌體的抑制作用，提高了WS100發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的效率。實驗采用的玉米漿和廢糖液是一種廉價的可再生的原料，更能夠顯著體現(xiàn)發(fā)酵可以不與人爭糧、不與人爭地的優(yōu)點(diǎn)，是一種有工業(yè)應(yīng)用前景的琥珀酸發(fā)酵的原料。本實驗室今后的研究著重于培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，增加WS100在玉米漿培養(yǎng)基中積累琥珀酸的產(chǎn)量，降低琥珀酸的生產(chǎn)成本，使廉價的玉米漿和廢糖液能代替無機(jī)鹽和葡萄糖制備琥珀酸成為可能。

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