竹葉抗氧化物作為大黃魚冷藏保鮮劑的生物學(xué)效應(yīng)研究

姜文進(jìn)，李 棟，黃駱鐮，吳曉琴，張 英

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)為廣溫廣鹽的肉食性魚類，是我國傳統(tǒng)的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類，素有“國魚”之稱。20世紀(jì)80年代以來，由于過度捕撈，大黃魚產(chǎn)量急劇下降。20世紀(jì)90年代初，大黃魚全人工養(yǎng)殖技術(shù)突破后產(chǎn)量逐年上升。同時，由于大黃魚體質(zhì)較嫩，在運輸過程中，極易導(dǎo)致充血、掉鱗、受傷、耳石中半硅管破裂，死亡率極高。為此，大部分大黃魚以冰鮮原條魚的形式運輸和銷售。目前，冷藏不僅能將魚肉細(xì)胞維持在活體狀態(tài)，還能有效抑制有害微生物的活動及各種酶的活性，是減緩魚肉腐敗變質(zhì)和延長貨架期的有效方法。然而，低溫條件并不能完全停止魚的生化反應(yīng)和抑制有害微生物的繁殖。此外，養(yǎng)殖大黃魚脂肪含量、尤其是不飽和脂肪酸含量較高，冷藏過程中易發(fā)生脂肪氧化，影響其貨架期。因此，在冷藏過程中，采用添加外源性的天然物食品添加劑，起到抑菌、保鮮、抗氧化的協(xié)同作用，不失為一種方便、經(jīng)濟(jì)、實用的技術(shù)手段。竹葉抗氧化物是本課題組創(chuàng)制的、具有本土資源特色和自主知識產(chǎn)權(quán)的、安全高效經(jīng)濟(jì)的天然食品抗氧化劑，于2004年4月被批準(zhǔn)列入《中華人民共和國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760)［1］，現(xiàn)允許使用的范圍包括:食用油脂、油炸堅果與籽類、油炸面制品、即食谷物、焙烤食品、肉制品、水產(chǎn)品、飲料和膨化食品，最大使用量0.5g/kg［2］。已知 AOB具有與茶多酚和 TBHQ等相當(dāng)?shù)目寡趸埽婢呖咕?、抑菌、抑制脂質(zhì)過氧化等多重生物學(xué)活性［2-3］。已有研究報道，0.2%的茶多酚(Tea Polyphenol)溶液應(yīng)用在大黃魚冷藏過程中能有效地抑制細(xì)菌繁殖、減緩脂肪氧化［4］，本實驗中作為AOB冷藏保鮮效果的對照。本實驗以竹葉抗氧化物為主要研究對象，通過對竹葉抗氧化物浸泡后的養(yǎng)殖大黃魚冷藏過程中pH、揮發(fā)性鹽基氮、質(zhì)構(gòu)和K值等指標(biāo)的變化進(jìn)行分析，評價其對大黃魚食用品質(zhì)和貨架壽命的影響，旨在為名優(yōu)水產(chǎn)品的冷鏈儲運過程中的品質(zhì)保持提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

養(yǎng)殖大黃魚(活魚)舟山東皇漁業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，為海水網(wǎng)箱激流養(yǎng)殖的閩東族種，平均條重在500～600g之間;竹葉抗氧化物(AOB-Ⅲ)杭州尤美特科技有限公司提供，總酚含量25%，其中異葒草苷含量1.2%;茶多酚 浙江大學(xué)茶學(xué)系提供，茶多酚含量為85%;殼聚糖(食品級)浙江金殼生物化學(xué)有限公司，乙酰化程度為95%;本實驗所用化學(xué)試劑 均為分析純;所用水 均為蒸餾水。

KJELTEC 2300全自動定氮儀 瑞典福斯特卡托公司;7530G紫外可見(UV-VIS)分光光度計 上海惠普分析儀器有限公司;AGB5型電子天平(十萬分之一)美國METTLER TOLEDO公司;DELTA pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;高效液相色譜儀 美國Waters 2695，配置Waters PDA2996檢測器;TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚處理方式 將運回的鮮活大黃魚試樣采用碎冰凍死后，隨機(jī)分成四組，分別為竹葉抗氧化物(AOB)實驗組(0.1%AOB、0.2%AOB水溶液)，陽性對照組(0.2%茶多酚水溶液)和空白對照組(生理鹽水)。各組大黃魚用溶液浸泡15min，取出瀝干后均勻涂抹殼聚糖溶液(1.5%殼聚糖+0.5%冰乙酸+0.5%甘油)，并用蒸煮袋包裝后放置于(4±1)℃冰箱中。樣品從放入冰箱開始，每2d測定一次，至第12d止。

1.2.2 魚肉pH測定 參考Arashisar等［5］的方法，稱取10g全魚肉樣品(沿脊骨剖切，去魚頭、魚尾、魚皮、內(nèi)臟，取全部魚肉，用組織搗碎機(jī)打碎)于燒瓶中，加入煮沸冷卻的蒸餾水100mL，攪勻后用pH計測其上清液pH。

1.2.3 魚肉 K值測定 按照J(rèn)ohn M Rvder［6］的方法進(jìn)行大黃魚ATP關(guān)聯(lián)物的萃取:取5g絞碎均勻的整魚魚肉(同上)于燒杯中，向燒杯中加入25mL冷卻的高氯酸(0.06mol/L)，充分勻漿后，3000r/min下離心10min去沉淀，取上清液10mL，用1mol/L KOH調(diào)節(jié)pH至6.5～6.8。靜置30min后于3000r/min下離心10min去除沉淀，取10mL上清液在-80℃凍藏用于后期檢測。整個過程均在0～4℃下操作。

大黃魚ATP關(guān)聯(lián)物的高效液相色譜(HPLC)檢測條件:色譜柱 ODS C18(250mm×4.6mm)，用0.04mol/L KH2PO4、0.06mol/L K2HPO4混和溶液作為流動相進(jìn)行平衡和梯度洗脫。上樣量為10μL，液相流速為 1mL/min，柱溫為 37℃，紫外檢測器波長為254nm。

K值的計算方法:魚肌肉中ATP按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx途徑降解，其K值計算公式如式(1):

式中，ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx 分別代表腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤的濃度(μmol/g，濕基)。K值越小表示鮮度越好，K值越大則鮮度越差。

1.2.4 魚肉中2-硫代巴比妥酸值(TBA)的測定 參考Siu等［7］的TBA測定方法，稱取10g攪碎均勻魚肉(同上)于燒杯中，向燒杯中加入25mL純水，充分勻漿后，再加入5%三氯乙酸(TCA)25mL，充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜止30min，過濾，再用5%三氯乙酸將濾液定容至50mL。取5mL上清液于比色管中，然后向比色管中加入5mL的TBA溶液(0.02mol/L)。將上述混合液在(80±1)℃的恒溫水浴加熱40min，之后冷卻至室溫后，在532nm下測定吸光度。TBA值用丙二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為mg/kg。TBA值單位為mg丙二醛/kg樣品。

1.2.5 魚肉中揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量的測定按照SC/T 3032-2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》［8］測定。

1.2.6 背肌的質(zhì)構(gòu)分析 測定時取背脊部魚肉，并將魚肉切成:長(7.0±1.0)cm、寬(4.0±1.0)cm、高(1.0±0.2)cm的魚塊，在TPA模式下測定。測定指標(biāo)包括硬度、彈性和咀嚼性、粘性、膠黏性、內(nèi)聚性、回復(fù)性。TPA模式參數(shù)設(shè)定參考戴志遠(yuǎn)等［9］的方法，測定具體參數(shù)為:使用平底柱形探頭p/75(75mm直徑)，測試前速率3mm/s，測試速率1mm/s，測試后速率1mm/s，壓縮程度50%，停留間隔時間5s，負(fù)重探頭類型:Auto=5g，數(shù)據(jù)收集率:200，環(huán)境溫度:12～16℃。每個樣品測6次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性檢驗采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用LSD方法進(jìn)行多重比較，以p＜0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中pH的變化

對某些水產(chǎn)品，pH可以作為鮮度變化的一項重要參考指標(biāo)［10］。養(yǎng)殖大黃魚魚肉的初始pH為6.81，在冷藏過程中pH呈先降后升的趨勢。這是因為魚體死后其肌肉中糖原經(jīng)過糖酵解途徑后產(chǎn)生乳酸等物質(zhì)，而使其肌肉中pH下降;之后隨著魚肉鮮度下降，肌肉中蛋白質(zhì)被分解，產(chǎn)生像氨和三甲胺等物質(zhì)，這些物質(zhì)多數(shù)呈現(xiàn)堿性，這又導(dǎo)致貯藏后期魚肌肉中的pH 逐漸上升［11］。

圖1為不同保鮮劑處理的試樣在冷藏過程中pH的變化。根據(jù)空白對照組pH變化情況，冷藏前8d，魚肉以肌肉中糖原酵解產(chǎn)生乳酸為主，實驗組和茶多酚對照組pH均高于空白對照組，AOB組高于對照組，表明AOB能有效抑制糖原酵解，且效果優(yōu)于茶多酚;8d以后，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物含量明顯增加，魚肉腐爛明顯，pH直線上升，實驗組和茶多酚對照組pH均低于空白對照組，且0.2%AOB組低于茶多酚對照組，結(jié)果表明，AOB具有延緩魚肉腐爛的作用，其保鮮作用優(yōu)于0.2%茶多酚。

圖1 不同保鮮劑處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中pH的變化Fig.1 Changes in pH of different fish samples during cold storage over time

2.2 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中TBA值的變化

硫代巴比妥酸值(TBA value)是檢測油脂氧化酸敗的有效方法，被廣泛用于測定脂類食品，特別是肉類和水產(chǎn)品脂肪氧化酸敗的程度，是判斷魚肉脂肪氧化程度的重要指標(biāo)［12］。不同處理的試樣在冷藏過程中TBA值的變化如圖2所示。

大黃魚魚肉初始的 TBA值為0.024mg/kg，在(4±1)℃的冷藏過程中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。12d后空白對照組的 TBA值達(dá)到了0.304mg/kg，0.1%AOB實驗組為 0.278mg/kg，茶多酚對照組為0.170mg/kg，而0.2%AOB實驗組為0.152mg/kg。前8d，0.2%AOB組的TBA值一直穩(wěn)定在較低的水平上，其他組并無顯著性差異;8d后，空白對照組和0.1%AOB組的TBA值迅速增長，而茶多酚對照組和0.2%AOB組雖然也有所增長，但仍遠(yuǎn)低于空白對照組。從TBA法測定結(jié)果分析，不同處理組的抗氧化性能強(qiáng)弱順序依次為:0.2%AOB＞0.2%茶多酚＞0.1%AOB＞空白對照組。可見，以0.2%濃度AOB溶液處理的效果最佳。研究表明，油脂的自動氧化是一個自由基鏈反應(yīng)，黃酮類化合物可以通過清除自由基，達(dá)到抗氧化的效果［13］。

2.3 冷藏過程中魚肉TVB－N值的測定結(jié)果分析

揮發(fā)性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)主要包括甲胺、二甲胺和三甲胺，它們是蛋白和非蛋白含氮化合物降解的產(chǎn)物［14］。魚死后，隨著蛋白質(zhì)的分解，三甲胺、二甲胺和氨類增多，產(chǎn)生腐敗氣味，影響魚肉的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值，TVB-N值是評價魚肉腐敗程度的重要指標(biāo)［15］。

經(jīng)過不同保鮮劑處理的試樣的TVB-N值變化如圖3所示。按照SC/T 3101-2010的規(guī)定，TVB-N≤13mg/100g屬于一級新鮮度，≤30mg/100g為合格品。養(yǎng)殖大黃魚魚肉初始的 TVB-N值(0d)為10.89mg/100g，為一級新鮮度;2d時，各組都超過了13mg/100g;4d時空白對照組顯著上升，達(dá)到29.53mg/100g，而經(jīng)保鮮劑處理的組變化不大。第6d時，各組的TVB-N值均顯著上升，但仍≤30mg/100g，仍為合格品;到第8d，空白對照組和0.2%AOB實驗組的TVB-N值＞30mg/100g;第10d，只有0.1%AOB組的TVB-N值≤30mg/100g，仍為合格品。從以上TVB-N測定結(jié)果分析，各組試樣的抗氧化強(qiáng)弱順序依次為:0.1%AOB＞0.2%茶多酚＞0.2%AOB＞空白對照組，以0.1%的AOB添加量為佳。

圖2 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中TBA值隨時間的變化Fig.2 Changes in thiobarbituric acid(TBA)of different fish samples during cold storage over time

圖3 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中TVB-N值隨時間的變化Fig.3 Changes in TVB-N value of different fish samples during cold storage over time

2.4 背肌的質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果分析

質(zhì)構(gòu)儀質(zhì)地多面分析(Texture Profile Analysis，TPA)是通過模擬人口腔的咀嚼運動對試樣進(jìn)行兩次壓縮，采用力學(xué)測試方法來模擬質(zhì)構(gòu)變化，它可以模擬反映出魚肉硬度、粘附性等參數(shù)［16］。硬度表現(xiàn)為人體的觸覺-柔軟或堅硬，使食品達(dá)到一定變形所需要的力，食品保持形狀的內(nèi)部結(jié)合力［17］。經(jīng)過保鮮劑處理和空白對照組大黃魚的硬度變化如表1所示。

不同處理的背肌試樣在冷藏過程中硬度隨時間的變化見表1。各組硬度的初始值第2d時均無顯著差異(p＞0.05);貯藏第4d，0.2%AOB組顯著大于空白對照組(p＜0.05);貯藏第6d，兩實驗組和陽性對照組均顯著大于空白對照組(p＜0.05);貯藏第8d，兩實驗組的硬度顯著大于空白對照組(p＜0.05)，而陽性對照組則跟空白對照組無顯著性差異(p＞0.05);貯藏第10d，兩實驗組的跟空白對照組無顯著差異(p＞0.05)，陽性對照組顯著小于空白對照組(p＜0.05);貯藏第12d，0.1%AOB組顯著低于空白對照組(p＜0.05)，0.2%AOB組和陽性對照組顯著高于空白對照組(p＜0.05)。從整體看，隨著保藏時間的延長，各組的硬度呈逐漸下降趨勢，可能是因為魚肉的腐敗變質(zhì)導(dǎo)致魚肉的硬度下降。下降幅度0.2%AOB組最小，與陽性對照組相比效果更好。這表明，0.2%的AOB對冷藏期間大黃魚魚肉的硬度有一定的保護(hù)效果。

粘附性是下壓一次后將探頭從試樣中拔出所需的能量大小，反映了在咀嚼魚肉時，食品表面與其物體(舌、齒、腭等)粘在一起的力。粘附性參數(shù)能夠反映魚肉細(xì)胞間結(jié)合力大小，細(xì)胞間結(jié)合力減少，則粘附性值增大［18］。經(jīng)過保鮮劑處理和對照組養(yǎng)殖大黃魚的粘附性變化如表2所示。

分析組間的粘附性數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)各組并無顯著性差異，這說明粘附性并不能作為評判AOB處理對大黃魚品質(zhì)影響的指標(biāo)。

表1 不同處理的背肌試樣在冷藏過程中硬度隨時間的變化(g)Table 1 Changes in hardness of the back muscles of different fish samples during cold storage over time(g)

表2 不同處理的背肌試樣在冷藏過程中粘附性隨時間的變化(g·s)Table 2 Changes in adhesion of the back muscles of different fish samples during cold storage over time(g·s)

2.5 魚肉K值的測定結(jié)果分析

因在死亡早期，細(xì)菌數(shù)量較少，但魚體自身的酶仍有活性，魚的早期鮮度取決于自身的生物化學(xué)反應(yīng)。K值能反映魚體死后ATP降解反應(yīng)進(jìn)行的程度，適合對魚類早期的鮮度作出評定［19］。我國國家標(biāo)準(zhǔn)中雖然尚未采用K值作為鮮度指標(biāo)，但在一些研究部門和水產(chǎn)品出口的鮮度檢測中已開始利用K值來評價魚肉鮮度。許多學(xué)者對K值與魚鮮度的關(guān)系進(jìn)行過研究［20］，利用K值評價大多數(shù)魚種的鮮度是比較適宜的，一般認(rèn)為即殺魚的K值在10%以下，作為生魚片的新鮮魚K值大約在20%以下，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚［21］。經(jīng)過保鮮劑處理和對照組養(yǎng)殖大黃魚在冰藏條件下K值的變化如圖4。

圖4 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中K值隨時間的變化Fig.4 Changes in K value of different fish samples during cold storage over time

由圖4可知，隨著冷藏天數(shù)的增加，K值呈現(xiàn)上升趨勢。冷藏0～4d的K值增加幅度最為明顯，4d后增長較緩慢，到8d后K值再次明顯上升。新鮮魚肉的K值為8.46%，冷藏2d后，除空白對照組，其他組都在20%以下，但接近20%。根據(jù)K值評價大黃魚新鮮度，實驗組和對照組大黃魚冷藏2d內(nèi)仍達(dá)到新鮮魚要求，而空白組大黃魚則為二級鮮度。到第4d后，各組K值變化趨于平緩。4～8d內(nèi)，K值變化不明顯，維持在40%左右，各組魚均達(dá)到二級鮮度要求。8d后，空白組大黃魚K值顯著增加，到10d已達(dá)62.25%，表明大黃魚開始腐敗。而兩個對照組和實驗組K值變化較小，仍顯著低于60%。從以上K值測定結(jié)果分析，AOB和茶多酚均能有效延長大黃魚的貯藏時間，不同保鮮劑處理的效果依次為:0.1%AOB＞0.2%茶多酚＞0.2%AOB＞空白對照組，以0.1%的AOB添加量為最佳。

3 結(jié)論

本研究以養(yǎng)殖大黃魚為實驗對象，對竹葉抗氧化物和茶多酚的保鮮效果進(jìn)行了對比研究，表明二者均能顯著延緩大黃魚在冷藏期間的腐敗變質(zhì)。采用0.1%的AOB溶液浸漬、輔以1.5%殼聚糖溶液的涂膜處理，可將(4±1)℃冷藏條件下的人工養(yǎng)殖大黃魚的貨架期延長，表明竹葉抗氧化物作為一種天然來源的生物保鮮劑在對產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部:2004年第6號公告.

［2］張英.天然功能性生葉提取物-竹葉黃酮［J］.中國食品添加劑，2002(3):54-58.

［3］張英.竹葉抗氧化物在食品工業(yè)中的應(yīng)用［c］.中國食品添加劑和配料協(xié)會.第十屆中國國際食品添加劑和配料展覽會學(xué)術(shù)論文集，2006.

［4］張旭光，李婷婷，勵建榮，等.茶多酚處理對冷藏養(yǎng)殖大黃魚品質(zhì)的影響［J］.茶葉科學(xué)，2011，3l(2):105-111.

［5］Arashisar S，Hisar O，Kayb M，et al.Effects of modified atmosphere and vacuum packaging on microbiologicaland chemical properties of rainbow trout(Oncorynchusmykiss)fillets［J］.Food Microbiology，2004，97:209-214.

［6］John M R.Determination of adenosine triphosphate and its breakdown products in fish muscle by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1985，33:678-680.

［7］SIU G M，DRAPER H.A survey of the malonaldehyde content of retail meats and fish［J］.Journal of Food Science，1978，43(4):1147-1149.

［8］SC/T 3032-2007水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定［S］.

［9］戴志遠(yuǎn)，崔雁娜，王宏海.不同凍藏條件下養(yǎng)殖大黃魚魚肉質(zhì)構(gòu)變化的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(8):188-191.

［10］陳佳榮，王以農(nóng).若干水產(chǎn)品變化鮮度的研究［J］.福建水產(chǎn)，1993(4):39-44.

［11］Siriporn R，Soottawat B，Wonnop V，et al.Effect of iced storage of bigeye snapper(Priacanthustayenus)on the chemical composition，properties and acceptability of Som-fug，a fermented Thai fish mince［J］.Food Chemistry，2007，102:270-280.

［12］C JO，D U AHN.Volatiles and oxidatives changes in irradiated pork sausage with different fatty acid composition and tocopherol content［J］.Journal of Food Science，2000，65:270-275.

［13］張靜，張曉鳴，佟建明，等.銀杏黃酮抑制脂質(zhì)氧化的研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報.2010，29(6):842-846.

［14］Goulas A E，Kontominas M G.Combined effects of light salting，modified atmosphere packaging and oregano essential oil on the shelf-life of sea bream(Sparusaurata):Biochemical and sensory attributes［J］.Food Chemistry，2007，100:287-296.

［15］V M OCANO-HIGUERA，E MARQUEZ-RIOSB，M CANIZALES-DOVILA，et al.Postmortem changes in cazon fish muscle stored on ice［J］.Food Chemistry，2009，116(4):933-938.

［16］劉亞軍，李紅波.物性分析儀及TPA在果蔬質(zhì)構(gòu)測試中的應(yīng)用綜述［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，30(2):188-192.

［17］李里特.食品物性學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:107-109.

［18］潘秀娟.蘋果采后質(zhì)地變化的破壞與非破壞檢測研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004:24-29.

［19］Saito T，Arai K，M atsugoshi M.A new method for estimating the freshness of fish［J］.Bull Jap Soc Sci Fish，1959，24:749-750.

［20］Ozogul Y，Ozogul F，Gokbulut C.Quality assessment of wild European eel(anguillaanguilla)stored in ice［J］.Food Chemistry，2006，95:458-465.

［21］Saito T，Arai K，M atsugoshi M.A new method for estimating the freshness of fish［J］.Bull Jap Soc Sci Fish，1959，24:749-750.