營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)糙米發(fā)芽富集GABA工藝條件優(yōu)化

蔣 靜，馬 濤

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866;2.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013)

發(fā)芽糙米含有豐富的維生素A、B、E和礦物元素鉀、鈉、鐵、鋅等，而且還含有多種促進(jìn)人體健康和防治疾病的成分，如谷胱甘肽、谷維素和阿魏酸，特別是糙米中的γ-氨基丁酸(GABA)含量在發(fā)芽時(shí)會(huì)大幅增加［1］。GABA具有改善腦機(jī)能，調(diào)整血壓，鎮(zhèn)靜神經(jīng)，促進(jìn)長(zhǎng)期記憶，促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，調(diào)節(jié)腎功能以及肝功能等作用［2］，因而受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。糙米發(fā)芽過(guò)程中，內(nèi)源的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)被活化，將糙米中的谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，從而顯著的提高GABA的含量，而GAD活性又受環(huán)境pH、谷氨酸濃度等因素的影響［3］。谷氨酸脫羧會(huì)造成反應(yīng)體系的pH不斷上升，使反應(yīng)速度下降，因此一般在緩沖體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而研究表明，不同的緩沖體系及其離子強(qiáng)度對(duì)GABA產(chǎn)量也有較大影響，張暉等研究發(fā)現(xiàn)PBS緩沖體系比MES緩沖體系中 GABA的產(chǎn)量高 28%［4］;谷氨酸鈉(MSG)相對(duì)谷氨酸溶解性好，價(jià)格低廉，且對(duì)發(fā)芽糙米富集GABA效果更佳。因此，本實(shí)驗(yàn)采用谷氨酸鈉(MSG)替代谷氨酸添加到PBS緩沖溶液中制成營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)糙米發(fā)芽。根據(jù)單因素結(jié)果，用 Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)糙米發(fā)芽富集GABA工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為糙米發(fā)芽富集GABA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試糙米 中稻股份有限公司，品種為遼星1號(hào);GABA標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;谷氨酸鈉(味精，谷氨酸鈉＞99%，無(wú)鹽)中外合資武漢味全食品有限公司;次氯酸鈉，分析純，有效氯為9% 廣東汕頭市西隴化工廠;重蒸苯酚，分析純 武漢天源生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼砂、硼酸和無(wú)水乙醇均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH.B11-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;HH-601A超級(jí)恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;SC-279GA海爾冰柜 海爾公司;UV1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海正慧工貿(mào)有限公司;PB-20標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)、1245電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽糙米的制備 發(fā)芽糙米的制備工藝流程如下:原料篩選→精選→殺菌→清洗→浸泡→發(fā)芽→清洗→干燥→成品。

為了有效控制糙米發(fā)芽過(guò)程微生物污染，將精選后的糙米用1.0%的次氯酸鈉溶液浸泡5min(加入量以剛好淹沒(méi)糙米為宜，下同［5］)，自來(lái)水沖洗3遍，加入4倍體積的水，恒溫浸泡。糙米浸泡后從燒杯中取出，用去離子水清洗，均勻地?cái)傆阡佊兴膶蛹啿嫉呐囵B(yǎng)皿中，其中紗布已用營(yíng)養(yǎng)液潤(rùn)濕。發(fā)芽過(guò)程中每隔4h加入1mL營(yíng)養(yǎng)液并上下翻動(dòng)糙米，以保證糙米在發(fā)芽期間的濕潤(rùn)狀態(tài)并防止種子部分接觸水面積時(shí)間較久腐爛發(fā)臭，并于一定溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)芽。發(fā)芽結(jié)束后，用去離子水清洗，于55℃烘箱中終止活性，干燥至5h，取出備用。

1.2.2 糙米吸水率的測(cè)定 將稱取的糙米分別放入20、25、30、35、40℃的恒溫水浴鍋中浸泡，每隔 2h 測(cè)定一次吸水率。糙米吸水率的計(jì)算公式如下:

1.2.3 GABA含量的測(cè)定 參考姚森［6］的方法并加以改進(jìn)，取2.5g發(fā)芽糙米，加適量蒸餾水研磨勻漿，然后定容至50mL，于30℃水浴中浸提2h，過(guò)濾后取濾液 0.5mL，加入 0.2mL 0.2mmol/L硼酸緩沖液(pH9.0)，1mL 6g/100mL重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量9%的NaClO溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即置于冰水浴中20min并不斷振蕩，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加2mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，通過(guò)GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.005X-0.032(Y為 GABA的濃度，mg/mL;X為 A645，R2=0.998)求出GABA含量。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)發(fā)芽溫度、發(fā)芽時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)液pH及MSG濃度4個(gè)因素實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)芽溫度(A)、發(fā)芽時(shí)間(B)、營(yíng)養(yǎng)液pH(C)及MSG濃度(D)四個(gè)因素與發(fā)芽糙米中GABA含量進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理［7］，通過(guò)Design Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)糙米發(fā)芽的最佳工藝條件。各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Four main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6 最佳發(fā)芽條件的驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert軟件求得回歸方程，以發(fā)芽糙米GABA含量最大化為目標(biāo)，計(jì)算得到培養(yǎng)發(fā)芽糙米工藝參數(shù)和理論含量，將得到的工藝參數(shù)修正以便于操作后，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)工藝參數(shù)的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡溫度和時(shí)間對(duì)糙米吸水率的影響

糙米浸泡溫度和時(shí)間與吸水率的關(guān)系見(jiàn)圖1，從圖1中可以看出，浸泡溫度對(duì)糙米吸水率有較大的影響。在30、35、40℃三個(gè)浸泡溫度條件下糙米吸水率較快。而在20、25℃浸泡條件下，需要較長(zhǎng)的浸泡時(shí)間才達(dá)到一定的吸水率。生產(chǎn)過(guò)程中提高溫度有利于縮短浸泡時(shí)間，減少營(yíng)養(yǎng)成分流失，但浸泡溫度也不能過(guò)高，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致熱溶性物質(zhì)流失，或者表層淀粉糊化［8］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大于30℃條件下浸泡，浸泡的糙米易產(chǎn)生發(fā)酵味，對(duì)后期培養(yǎng)糙米發(fā)芽產(chǎn)品品質(zhì)有嚴(yán)重影響。考慮生產(chǎn)實(shí)際，浸泡溫度為30℃比較適宜。

圖1 不同浸泡條件下糙米的吸水率Fig.1 Effect of soaking condition on the water absorbability of brown rice

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響 將糙米30℃溫度下浸泡12h，用谷氨酸鈉(MSG)濃度為2.0mg/mL的pH5.6 PBS緩沖溶液(0.05mol/L)作為營(yíng)養(yǎng)液在不同溫度 20、25、30、35、40℃下培養(yǎng) 24h，其它過(guò)程同“1.2.1”，以GABA含量為考察指標(biāo)。結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)芽溫度對(duì)GABA含量的影響Fig.2 Effect of germination temperature on the GABA content

由圖2可看出，在一定溫度范圍內(nèi)，GABA含量隨發(fā)芽溫度升高而升高。在30℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降。溫度過(guò)高和過(guò)低對(duì)糙米種子發(fā)芽均不利，適宜的溫度是增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成GABA的必要條件［9］。本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)芽溫度30℃較為適宜。

2.2.2 發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響 將糙米30℃溫度下浸泡12h，用谷氨酸鈉(MSG)濃度為2.0mg/mL的pH5.6 PBS緩沖溶液(0.05mol/L)作為營(yíng)養(yǎng)液在30℃下分別培養(yǎng) 8、16、24、32、40h，其它過(guò)程同“1.2.1”，以GABA含量為考察指標(biāo)。結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA含量的影響Fig.3 Effect of germination time on the GABA content

由圖3可看出，GABA含量在培養(yǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。24h時(shí)達(dá)到最大值;24h以后呈下降趨勢(shì)。分析其原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，轉(zhuǎn)換成琥珀酸半醛，使GABA含量下降［10］。在本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)芽時(shí)間24h較為適宜。

2.2.3 營(yíng)養(yǎng)液pH對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響將糙米 30℃溫度下浸泡 12h，分別用谷氨酸鈉(MSG)濃度為 2.0mg/mL 的 pH5.3、5.6、5.9、6.2、6.5PBS緩沖溶液(0.05mol/L)作為營(yíng)養(yǎng)液在30℃下培養(yǎng)24h，其它過(guò)程同“1.2.1”，以GABA含量為考察指標(biāo)。結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)GABA含量的影響Fig.4 Effect of pH on the GABA content

由圖4可看出，當(dāng)pH5.6時(shí)，發(fā)芽糙米中GABA含量最高，這與資料報(bào)道相一致［11］。GABA是生物體在逆境條件下緩解細(xì)胞酸化對(duì)自身毒害作用的產(chǎn)物，其合成途徑為 Glu在 GAD催化條件下形成GABA，弱酸條件能促進(jìn)GABA的合成［12］。植物組織中GAD的最適pH為5～6，GABA轉(zhuǎn)氨酶最適pH則為9左右。酸性條件利于形成逆境，從而使發(fā)芽糙米中GABA大量積累。當(dāng)pH＞5.6時(shí)，隨著營(yíng)養(yǎng)液pH的繼續(xù)增加，GABA的含量呈顯著下降趨勢(shì)，這是由于在較高pH環(huán)境下GAD活性相對(duì)降低，GABA轉(zhuǎn)氨酶相對(duì)增加，從而影響發(fā)芽糙米富集GABA。在本實(shí)驗(yàn)條件下，營(yíng)養(yǎng)液pH5.6較為適宜。

2.2.4 MSG濃度對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響 將糙米30℃溫度下浸泡12h，分別用谷氨酸鈉(MSG)濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL 的 pH5.6 PBS 緩沖溶液(0.05mol/L)作為營(yíng)養(yǎng)液在30℃下培養(yǎng)24h，其它過(guò)程同“1.2.1”，以GABA含量為考察指標(biāo)。結(jié)果如圖5所示。

圖5 MSG對(duì)GABA含量的影響Fig.5 Effect of MSG on the GABA content

由圖5可看出，隨谷氨酸鈉濃度增加，GABA含量呈現(xiàn)上升和下降的趨勢(shì)。分析其原因可能是隨著谷氨酸鈉濃度的增加，谷氨酸脫羧酶可利用的底物逐漸增多，當(dāng)達(dá)到2.0mg/mL時(shí)，底物與酶達(dá)到一個(gè)最適比例，隨后濃度的增加造成營(yíng)養(yǎng)液中離子濃度的增加，從而給細(xì)胞壁較大壓力，堵塞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸通道，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)不能自由進(jìn)出細(xì)胞，從而不利于GABA的合成與運(yùn)送［13］。在本實(shí)驗(yàn)條件下，MSG濃度為2.0mg/mL時(shí)較為適宜。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化糙米發(fā)芽條件結(jié)果分析

2.3.1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼與實(shí)驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依次進(jìn)行浸泡培養(yǎng)發(fā)芽，以發(fā)芽糙米中GABA含量為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

續(xù)表

2.3.2 回歸模型的建立及統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Design Expert 8.0軟件處理確定回歸方程，該實(shí)驗(yàn)的回歸方程為:

回歸模型進(jìn)行方差分析及可信度分析結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為:Y=210.8+14.09A+9.8B+15.73C+12.05D-20AB-10.88AC-26.82A2-16.95B2-22.84C2-26.23D2

根據(jù)表3可知，該回歸模型顯著(p＜0.0001)方程的一次性和二次項(xiàng)的影響都顯著，且交互項(xiàng)AB、AC也顯著，且該模型極顯著(p＜0.01)，因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9428)，模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.9155，說(shuō)明該模型能解釋91.55%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好。失擬項(xiàng)不顯著(p＞0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)［14］。

2.3.3 響應(yīng)面因素水平的優(yōu)化 回歸方程中影響顯著的交互項(xiàng)所做的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6。

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，運(yùn)用Design Expert 8.0軟件對(duì)模型進(jìn)行分析，尋求發(fā)芽糙米GABA含量最大值的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，由圖6可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即極大值點(diǎn)，通過(guò)對(duì)回歸模型求一階偏導(dǎo)，得到各因素A、B、C、D的編碼值為 0.154、0.100、0.269、0.172，利用編碼公式Xi=(Xj-X0)/Δj將上述編碼值轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際參數(shù)為:發(fā)芽溫度30.7℃、發(fā)芽時(shí)間24.8h、營(yíng)養(yǎng)液pH5.68和MSG濃度2.09mg/mL，此時(shí)發(fā)芽糙米GABA含量為215.5mg/100g。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，得發(fā)芽糙米GABA含量實(shí)測(cè)值為210.8mg/100g，與理論值215.5mg/100g接近，可以用此模型預(yù)測(cè)并指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際。

3 結(jié)論

表3 回歸方程的統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

采用Box-Behnken響應(yīng)面法建立影響因素的二次回歸模型，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，糙米在30℃浸泡12h后，其富集 GABA的最佳工藝條件為發(fā)芽溫度30.7℃、發(fā)芽時(shí)間24.8h、營(yíng)養(yǎng)液pH5.68和MSG濃度2.09mg/mL。擬合實(shí)驗(yàn)誤差小，可為實(shí)際預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)發(fā)芽糙米GABA含量提供理論依據(jù)。

圖6 各兩因素交互作用對(duì)GABA含量影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on the GABA content

［1］Takayo Saikusa，Toshiroh Horino，Yutaka Mori.Accumulation of γ-aminobutyric acid in the rice germ during water soaking［J］.Biosci Biotech Biochem，1994，58(12):91-92.

［2］王玉萍，韓永斌，顧振新，等.谷氨酸鈉和抗壞血酸對(duì)發(fā)芽糙米中GABA富集效果的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(2):94-97.

［3］Aurisano N，Bertani A，Reggiani R.Anaerobic accumulation of γ-aminobutyric in rice seedlings:Causes and Significance［J］.Phytochemistry，1995，38(5):1147-1150.

［4］姚森.高γ-氨基丁酸含量的發(fā)芽糙米品種篩選及應(yīng)用［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［5］孟祥勇.糙米、大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸及復(fù)合谷物飲料的研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2009.

［6］姚森，鄭理，趙思明，等.發(fā)芽條件對(duì)發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影響［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(12):211-215.

［7］JOSHI S，YADAV S，DESAI AJ.Application of responsesurface methodology to evaluate the optimum medium components for the enhanced production of lichenysin by Bacillus licheniformis R2［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，41(2):122-127.

［8］張群，單楊.糙米浸泡過(guò)程中γ-氨基丁酸的變化［J］.糧食與飼料工業(yè)，2006(11):6-8.

［9］李冰冰，王玉萍，顧振新，等.發(fā)芽糙米與稻谷的谷氨酸脫梭酶活力及 γ-氨基丁酸含量比較［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，2(5):28-30.

［10］張暉.米胚芽谷氨酸脫羧酶性質(zhì)及其富集γ-氨基丁酸研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2004.

［11］Wallance W，Secor J，Schrader LE.Rapid accumulation of γ-aminobutyric acid and alanine in soybean leaves in response to an abrupt transfer to lower temperature，darkness or mechanical manipulation［J］.Plant Physiol，1984，75:170-175.

［12］蔣振輝，顧振新.高等植物體內(nèi)γ-氨基丁酸合成、代謝及生理作用［J］.植物生理學(xué)通訊，2003，39(3):249-255.

［13］韓永斌，顧振新，蔣振輝.Ca2+浸泡處理對(duì)發(fā)芽糙米生理指標(biāo)和 GABA等物質(zhì)含量的影響［J］.食品科學(xué)，2006，27(10):26-27.

［14］吳竹青，陳景，黃群，等.響應(yīng)面法優(yōu)化雪蓮果酒發(fā)酵工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31(23):182-187.