小叢紅景天多糖含量測(cè)定及生物學(xué)活性研究

王 莉，趙 樺，徐 皓

1陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中723000;2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070

小叢紅景天［Rhodiola dumulosa(Franeh)S．H．Fu］為景天科紅景天屬植物，又名鳳尾七、風(fēng)尾草、鳳凰草、香景天［1］。它是一種民間常用的藥用植物，是陜西省地道藥材“七藥”之一。藥理學(xué)研究證明紅景天具有抗缺氧、抗疲勞、抗微波輻射、抗毒、抗癌、抗老化、抗不良刺激、活血化淤等功效［2］。

一些研究表明多糖不僅是生物體必不可少的成分，而且還具有多種生理機(jī)能，如真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等多種生物學(xué)活性，已被開(kāi)發(fā)成多種藥物和功能性食品添加劑。大量研究表明中藥材多糖具有多種生理活性，如增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護(hù)等［3-5］。研究表明，中藥紅景天的紅景天多糖具有特殊的生理活性和藥理作用，對(duì)抗輻射、抗疲勞、抗病毒、提高免疫力、抗癌、降血糖、抗缺鐵性貧血、抗肺炎性哮喘、抗氧化、抗菌以及冷凍保存精子保護(hù)等方面均有作用［6］。目前對(duì)小叢紅景天化學(xué)成分的系統(tǒng)研究報(bào)道較少［7，8］，對(duì)小叢紅景天多糖的研究尤其是多糖的含量測(cè)定及抗氧化活性方面的報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用秦巴山區(qū)產(chǎn)小叢紅景天為材料，重點(diǎn)分析研究其多糖類(lèi)化合物的含量及體外抗氧化活性，深入了解小叢紅景天藥材中有效成分的基本情況，為該藥材的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用藥材小叢紅景天(鳳尾七)為景天科植物小叢紅景天［Rhodiola dumulosa(Franch．)S．H．Fu］的干燥根莖，均購(gòu)自陜西漢中中藥材市場(chǎng)，并經(jīng)漢中藥檢所彭強(qiáng)主任藥師鑒定。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器

AB204-型電子分析天平(梅特勒);HH-4型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉儀器有限公司);UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津);KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);722-光柵分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠(chǎng))。

1．2．2 試劑

無(wú)水乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)、硫酸亞鐵(國(guó)產(chǎn)分析純)、30%雙氧水(國(guó)產(chǎn)分析純)、磷酸氫二鈉(國(guó)產(chǎn)分析純)、磷酸二氫鈉(國(guó)產(chǎn)分析純)、鄰菲啰啉(國(guó)產(chǎn)分析純)、2，2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)(Sigmaaldrich公司);叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ，色譜純)，Sigma-aldrich公司;抗壞血酸(Vc)、純凈水。2 g/L的蒽酮硫酸溶液(精密稱(chēng)取蒽酮0．2 g溶于100 mL濃硫酸中，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 小叢紅景天中多糖提取及精制

2．1．1 提取流程

50℃烘干藥材→粉碎過(guò)24目篩→乙醚索氏提取脫脂→95%乙醇回流提取(去除單糖、低聚糖、苷類(lèi)及生物堿等干擾成分)→抽濾→所得濾渣按一定料液比進(jìn)行超聲浸提→抽濾→濾液水浴濃縮→加入乙醇，使乙醇含量達(dá)到80%以上靜置過(guò)夜→抽濾，回收乙醇→所得沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌→揮干溶劑后，50℃烘干，得到粗多糖。

2．1．2 精制流程

稱(chēng)取1．0 g粗多糖，用100 mL純凈水溶解，加入一定量的10%三氯乙酸，振蕩后冷藏靜置12 h，離心15 min(3500 rpm)，合并濾液且減壓濃縮至適量體積，加入無(wú)水乙醇使其含醇量達(dá)80%以上，靜置過(guò)夜，抽濾，洗滌，干燥，得去蛋白多糖。

2．2 小叢紅景天多糖含量測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法測(cè)定植物多糖含量［9］。

2．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

精密稱(chēng)取烘至恒重的無(wú)水葡萄糖25 mg，置于500 mL容量瓶中，用無(wú)離子水溶解并定容至刻度，即配成50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別精密吸取0．4、0．8、1．2、1．6、2．0 mL 儲(chǔ)備液置于試管中，加入1 mL蒸餾水，再分別加入10 mL 2 g/mL的蒽酮–硫酸試劑(冰水浴中)，搖勻，沸水浴15 min，取出后于冰水浴中冷卻至室溫。在620 nm處測(cè)吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2．2．2 樣品溶液制備

稱(chēng)取小叢紅景天藥材粉末10．00 g，以乙醚為溶劑，45℃索氏提取儀去脂至乙醚為無(wú)色;藥渣揮干乙醚，置于圓底燒瓶中，用95%的乙醇90℃回流2 h;抽濾，所得濾渣按一定料液比加蒸餾水，超聲波浸提(按一定的超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)浸提)，抽濾，濾液水浴濃縮，加入乙醇，使乙醇含量達(dá)到80%以上，直到不再產(chǎn)生新的沉淀為止，靜置過(guò)夜;抽濾，回收乙醇，所得沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌;揮干溶劑后，50℃烘干，得到粗多糖。精密稱(chēng)取粗多糖粉末10 mg，于100 mL容量瓶中，用無(wú)離子水溶解并定容至刻度，備用。

2．2．3 小叢紅景天多糖含量測(cè)定方法學(xué)考察

2．2．3．1 穩(wěn)定性

精密吸取1 mL樣品溶液于試管中，參照2．2．1同樣顯色操作處理，測(cè)定吸光值A(chǔ)，考察同一樣品在135 min內(nèi)的吸光值穩(wěn)定性(n=3)。吸光值在0～105 min中內(nèi)較為穩(wěn)定，其平均值為0．265，RSD為0．8%，證實(shí)樣品在105 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．2．3．2 精密度

精密吸取1 mL供試液于試管中，按照2．2．1測(cè)定方法測(cè)定其吸光值，連續(xù)測(cè)定6次，考察實(shí)驗(yàn)精密度性。吸光值平均值為0．263，RSD為0．3%，顯示實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2．2．3．3 重現(xiàn)性

按照供試液制備方法制備小叢紅景天多糖供試品溶液6份，按照2．2．3．1測(cè)定方法測(cè)定其吸光值測(cè)定其吸光值，考察實(shí)驗(yàn)重性。吸光值平均值為0.264，RSD值為1．0%，表明實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性好。

2．2．3．4 加樣回收率

精密吸取已知多糖含量供試液5份，溶液中加入一定量的對(duì)照品。按照2．2．3．1測(cè)定方法測(cè)定其吸光值，連續(xù)測(cè)定5組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，小叢紅景天多糖的平均回收率為97．76%，RSD為0．56%。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 1 Results of recovery tests(n=5)

2．2．4 小叢紅景天多糖含量檢測(cè)

精密吸取1mL樣品溶液于試管中，參照2．2．1同樣顯色操作處理，測(cè)定吸光值A(chǔ)。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可計(jì)算小叢紅景天多糖的濃度C(小叢紅景天多糖濃度以葡萄糖濃度計(jì))和多糖含量。

多糖含量(%)=［(C×N×V)/m2×1000］×m1/M

式中:C為樣品液中多糖的質(zhì)量濃度(μg/mL);N為稀釋因子;V為樣品液的體積(mL);m1為粗多糖質(zhì)量(g);m2為測(cè)量時(shí)所取的粗多糖質(zhì)量(mg);M為樣品質(zhì)量(g)。

2．3 小叢紅景天多糖的體外抗氧化活性

2．3．1 對(duì)羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定

采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基。取0．75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1．0 mL，加50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)1．5 mL，加 0．75 mmol/L 的 FeSO4溶液 1．0 mL，加0.01%的H2O21．0 mL，每加一管立即混勻，最后以純凈水補(bǔ)充總體積至10．0 mL。多糖溶液及Vc溶液清除·OH的作用，依上法分別加入不同濃度的多糖和Vc溶液2．0 mL后再加入0．01%的H2O2。反應(yīng)液37℃反應(yīng)1 h，于536 nm處測(cè)吸光度A。未損傷管為不加H2O2及多糖溶液或Vc溶液，損傷管只加H2O2溶液［10］。按照以下公式計(jì)算對(duì)羥自由基(·OH)的清除率。

清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100%

2．3．2 對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)清除率的測(cè)定

加入由50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)配制的5 mmol/L的H2O2溶液2．8 mL，再加入不同濃度的多糖和Vc溶液1．0mL，用純凈水補(bǔ)齊至10．0 mL，室溫放置10 min后，于波長(zhǎng)230 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，對(duì)照為不加多糖或者Vc溶液［11］。按照以下公式計(jì)算過(guò)氧化氫(H2O2)的清除率。

清除率(%)=(A樣品-A對(duì)照)/A對(duì)照×100%

2．3．3 對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定

取2×10-4moL/L的DPPH·無(wú)水乙醇溶液2．0 mL，加入2．0 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液，室溫(25℃)反應(yīng)40 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定2．0 mLDPPH·和2．0 mL 無(wú)水乙醇在517 nm處的吸光度Ac，以及2．0 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液和2．0 mL無(wú)水乙醇混合液在517 nm處測(cè)定吸光度Aj。按照下式計(jì)算不同濃度受試物對(duì)DPPH·的清除率(%)［12］。按照以下公式計(jì)算對(duì)DPPH·的清除率。

清除率(%)=［(Ac+Aj)-Ai］÷Ac×100%

2．4 小叢紅景天多糖的抑菌活性

微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)，同時(shí)采用平板轉(zhuǎn)種法測(cè)定最小殺菌濃度(MBC)。將樣本溶于MH肉湯并進(jìn)行二倍連續(xù)梯度稀釋?zhuān)♂尩臉颖疽阂来渭拥?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0．2 mL/孔。于每孔加入106CFU/mL菌液20μL。4℃冰箱作用12 h，置37℃培養(yǎng)48 h觀(guān)察結(jié)果。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小樣本濃度為最小抑菌濃度(MIC)。將無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔中培養(yǎng)液取20μL接種于MH平板，37℃培養(yǎng)48 h觀(guān)察結(jié)果，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)接種區(qū)域?qū)?yīng)的樣本最小濃度為最小殺菌濃度(MBC)［13］，重復(fù)兩次。

3 結(jié)果與分析

3．1 小叢紅景天多糖含量

按照2．2．1項(xiàng)下方法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程為:A=0．0032C+0．0008(R2=0．9995)。其濃度在20．00～100．00 μg/mL 范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

按照2．2．4項(xiàng)下方法，測(cè)得小叢紅景天樣品中粗多糖的含量為4．08%。

3．2 對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，小叢紅景天粗多糖、去蛋白多糖和Vc三者對(duì)·OH的清除率均隨濃度的增加而增大。Vc清除率增加最快，當(dāng)濃度為0．06 mg/mL時(shí)，清除率已達(dá)100%，而在此濃度下，小叢紅景天粗多糖對(duì)·OH的清除率為41．28%，去蛋白精制多糖對(duì)·OH的清除率為24．68%，由此說(shuō)明小叢紅景天粗多糖和去蛋白多糖對(duì)·OH的清除能力弱于Vc。

當(dāng)濃度為0．1 mg/mL時(shí)，小叢紅景天粗多糖對(duì)·OH的清除率也能達(dá)到100%;而在此濃度下，小叢紅景天去蛋白多糖的清除率為71．28%。這說(shuō)明去蛋白多糖對(duì)·OH的清除率有所下降。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

3．3 對(duì)過(guò)氧化氫(H2 O2)的清除作用

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，小叢紅景天粗多糖、去蛋白多糖和Vc三者對(duì)H2O2的清除率均隨濃度增加而增大，且Vc的清除作用增加較快，當(dāng)濃度為0．02 mg/mL時(shí)，Vc的清除率達(dá)到100%，而粗多糖的清除率也能達(dá)到57．39%，但去蛋白多糖的清除率僅為35．13%。當(dāng)濃度為0．35 mg/mL時(shí)，粗多糖對(duì)H2O2的清除率能達(dá)到100%，而在此濃度下去蛋白多糖對(duì)H2O2的清除率僅接近80%。研究結(jié)果說(shuō)明小叢紅景天粗多糖對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除作用，去蛋白多糖的清除作用弱于粗多糖。測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

3．4 對(duì)DPPH·的清除作用

測(cè)定結(jié)果如圖3所示:粗多糖和去蛋白多糖的清除率隨實(shí)驗(yàn)濃度的增加而增大，且增加趨勢(shì)基本成線(xiàn)性關(guān)系，當(dāng)濃度為0．5 mg/mL時(shí)，粗多糖對(duì)DPPH·的清除率為76．54%，而去蛋白多糖的清除率為57．69%。說(shuō)明小叢紅景天粗多糖對(duì)DPPH·有較好的清除作用，去蛋白多糖的清除作用弱于粗多糖。相比之下，在Vc和TBHQ的濃度達(dá)到0．1 mg/mL時(shí)，二者對(duì)DPPH的清除率分別為95．31%和92．62%，此后隨著實(shí)驗(yàn)濃度的變化Vc和TBHQ對(duì)DPPH·的清除率的變化不大。

3．5 小叢紅景天多糖的抑菌活性

如表5所示:小叢紅景天多糖對(duì)選定的白假絲酵母菌(CMCC85021)、枯草芽胞桿菌(CMCC63501)、金黃色葡萄球菌(ATCC25925)和大腸埃希氏菌(ATCC25922)四種供試菌株均有很好的抑制作用，小叢紅景天多糖對(duì)四種供試菌株的抑制作用能力大小順序?yàn)榘准俳z酵母菌＞大腸埃希氏菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

表2 小叢紅景天多糖的抑菌效果Table 2 Antimicrobial activity of R．dumulosa polysaccharide

4 討論

本實(shí)驗(yàn)初步建立了小叢紅景天中多糖的含量測(cè)定方法，方法簡(jiǎn)便、可靠、穩(wěn)定性好，為小叢紅景天多糖的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供了一定基礎(chǔ)。

本研究測(cè)得小叢紅景天多糖的含量為4．08%。方勇(2011)曾對(duì)生長(zhǎng)于不同地區(qū)的6種紅景天植物多糖進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)其多糖的含量有較大的差別。其中高山紅景天多糖含量為4．87%，圣地紅景天3．50%，狹葉紅景天2．98%，玫瑰紅景天2.81%，西藏大花紅景天1．98%，四川大花紅景天1．06%［14］。相比之下，生長(zhǎng)于陜西秦嶺的小叢紅景天其多糖含量較高，僅次于高山紅景天的多糖含量。

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:小叢紅景天粗多糖和去蛋白多糖對(duì)·OH、H2O2和DPPH·有一定的清除作用，清除作用與濃度成正相關(guān)。其中，當(dāng)粗多糖濃度達(dá)到一定值時(shí)，粗多糖對(duì)H2O2和·OH的清除率均可達(dá)到100%，其清除作用與Vc相當(dāng)。相比之下去蛋白多糖對(duì)幾種自由基的清除作用弱于粗多糖的。這可能是在粗多糖去蛋白的過(guò)程中，有一部分與蛋白質(zhì)結(jié)合的活性糖被一同去除，使其對(duì)自由基的清除作用下降。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明:小叢紅景天多糖具有一定的抑菌活性，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和白色假絲酵母均有很好的抑制作用，尤其對(duì)白色假絲酵母抑制作用明顯。

研究表明，小叢紅景天植物多糖含量較高，體外實(shí)驗(yàn)證明其具有良好的清除自由基和抑菌、殺菌生物活性。因此，小叢紅景天多糖在醫(yī)藥、保健方面，具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

致謝:本文抑菌實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與病原生物學(xué)系完成，陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院生工082班寇慶同學(xué)參與部分實(shí)驗(yàn)工作，謹(jǐn)此表示感謝!

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