黃連粉末中鹽酸小檗堿及鹽酸藥根堿的體內(nèi)腸吸收特性＊

魏世超， 徐麗君， 鄒 欣， 陸付耳， 王開富

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1藥學(xué)部，2中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030

黃連用于治療消渴癥（相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病）已有兩千多年的歷史［1］，形成了系統(tǒng)的理論，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。我們檢索發(fā)現(xiàn)：冠名“黃連丸”治療消渴癥的古方就有15種之多，而且在這些方藥中均以黃連為主藥且以其粉末制丸。諸多研究表明，小檗堿（Berberine）、藥根堿（Jatrorrhizine）是目前黃連治療2型糖尿病最受關(guān)注的有效成分，鹽酸小檗堿現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療［1－5］。據(jù)報(bào)道，鹽酸小檗堿高達(dá)95%未被小腸吸收，其口服應(yīng)用時(shí)，有效劑量較大［4－7］，這一缺陷被臨床醫(yī)師戲稱 “吃藥如同吃飯”，且由于可能破壞腸道菌叢的平衡而嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。該系列研究結(jié)果似乎與古方黃連丸劑在糖尿病（消渴癥）中的廣泛應(yīng)用形成了矛盾。因此，本研究采用大鼠體內(nèi)腸灌注實(shí)驗(yàn)，研究大鼠小腸對(duì)黃連粉末中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿的腸吸收特性，從一個(gè)側(cè)面探討黃連粉末治療消渴癥的科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters高效液相色譜（HPLC）儀（600泵，717自動(dòng)進(jìn)樣器，2457熒光檢測器，Waters公司，美國）；Waters色譜工作站；SK-2200LH 超聲波清洗器（無錫建儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；紫外分光光度計(jì)（U-1900，日本島津公司）；HL-2型恒流泵（上海盧西分析儀器廠有限公司）；BT25-型電子天平（日本島津公司）；恒溫循環(huán)水浴鍋（Grant Y14-VFP，英國）；2-16K臺(tái)式高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；中藥粉碎機(jī)（WARING 24CB10C，美國）。

1.2 動(dòng)物與試藥

1.2.1 動(dòng)物 Wister大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量（256.3±13.6）g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，合格證號(hào)：SYXK（鄂）2010-0057。

1.2.2 試藥 黃連由武漢中藥飲片廠提供，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定本品為毛茛科植物黃連（Coptis ChinensisFranch）的干燥根莖；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-200208，99.0%，中國藥品生物制品檢定所）；鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)：120756-200808，98.0%，中國藥品生物制品檢定所）；烏拉坦（批號(hào)：1700063-50G，含量98%，廣州威佳科技有限公司）；酚紅（美國AMRESCO公司）；甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）及其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 酚紅貯備液 精密稱取酚紅25mg置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 Kerbs-Ringer營養(yǎng)液（K-R營養(yǎng)液） 參照文獻(xiàn)［8］制備。分別取氯化鈉7.8g，氯化鉀0.35g，氯化鈣0.37g，碳酸氫鈉1.37g，磷酸二氫鈉0.32 g，氯化鎂0.02g，葡萄糖1.40g，置于1L容量瓶中，蒸餾水溶解，稀釋至刻度，即得。

1.3.3 模擬胃液 精密稱取胃蛋白酶3.20g，氯化鈉2.00g置于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，用10%稀鹽酸調(diào)pH至1.2，定容，即得。

1.3.4 模擬腸液 參照文獻(xiàn)［9］制備。精密稱取0.68g磷酸二氫鉀，1.00g胰蛋白酶置于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.6，定容，即得。

1.4 酚紅、鹽酸小檗堿與鹽酸藥根堿含量測定時(shí)檢測波長的選擇

分別用K-R營養(yǎng)液配制24.75mg／L鹽酸小檗堿、5.80mg／L 鹽酸藥根堿對(duì)照品溶液和 18.00 mg／L的酚紅溶液（取0.5mL酚紅貯備液加0.2 mol／L的氫氧化鈉溶液5mL顯色）。分別取上述溶液和K-R營養(yǎng)液腸循環(huán)2.5h后所得的空白腸循環(huán)液，在200～700nm處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果顯示，在酚紅吸收峰（558nm）處，鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿及空白腸循環(huán)液均無吸收干擾；而在鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿吸收峰（345nm）處，酚紅及空白腸循環(huán)液亦無吸收干擾。故用紫外分光光度法測定酚紅的濃度時(shí)選擇558nm波長；而用HPLC測定鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿的濃度時(shí)選用345nm檢測波長。

1.5 腸循環(huán)液中酚紅的測定

1.5.1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 方法參照文獻(xiàn)［10-11］。精密量取酚紅貯備液適量，用K-R營養(yǎng)液配制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg／L的系列溶液，分別精密量取0.5mL，加入0.2mol／L NaOH溶液5mL，搖勻，在558nm波長處測定吸光度值Y，以Y對(duì)質(zhì)量濃度（C，mg／L）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y酚紅＝0.013 2C－0.0127，r＝0.999 2，表明酚紅濃度在1.25～40.00mg／L范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。低、中、高（1.25、20.00、40.00mg／L）3種濃度的方法回收率分別為100.1%、101.9%、99.1%，日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）均小于2.5%。

1.5.2 酚紅濃度的測定 在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取腸循環(huán)液0.5mL，加入0.2mol／L NaOH 溶液5mL，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液于558nm波長處測定Y值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算酚紅濃度。

1.6 腸循環(huán)液中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿的測定

1.6.1 色譜條件 色譜柱 Waters C18柱（250nm×4.6nm）；流動(dòng)相為50mmol／L的磷酸二氫鉀溶液-乙腈（55∶45）（以磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0，加入SDS至終溶液濃度25mmol／L）；流速為0.5mL／min；檢測波長為345nm；進(jìn)樣量為20μL；柱溫為30℃。

取適宜濃度的鹽酸小檗堿與鹽酸藥根堿對(duì)照品溶液、體內(nèi)腸循環(huán)后樣品液和空白腸循環(huán)液，在上述色譜條件下測定，鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿的保留時(shí)間分別約為27min和39min，樣品液的2個(gè)主峰保留時(shí)間分別與對(duì)照品主峰保留時(shí)間一致，空白無干擾。見圖1。

1.6.2 鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿在空白腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性 取大鼠1只，做全腸段插管，用K-R營養(yǎng)液（含酚紅20mg／L）循環(huán)3h，分別用此空白腸循環(huán)液配制24.75mg／L的鹽酸小檗堿溶液和11.60 mg／L的鹽酸藥根堿溶液。于（37±0.5）℃保存24 h。分別于0、4、8、12、16、20、24h測定，觀察峰面積的變化情況并計(jì)算其RSD。結(jié)果，鹽酸藥根堿RSD為1.56%，鹽酸小檗堿RSD為1.12%，表明鹽酸藥根堿和鹽酸小檗堿在空白腸循環(huán)液中24h內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

1.6.3 鹽酸小檗堿及鹽酸藥根堿腸循環(huán)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取19.8mg鹽酸小檗堿及4.64mg鹽酸藥根堿對(duì)照品置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別用含酚紅的K-R營養(yǎng)液（酚紅20mg／L）等比稀釋成濃度為3.094、6.188、12.375、24.750、49.500、99.000 mg／L的鹽酸小檗堿溶液及 0.725、1.450、2.900、5.800、11.600、23.200mg／L的鹽酸藥根堿溶液。于1.6.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL測定。以峰面積（Y）對(duì)濃度（C，mg／L）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：Y鹽酸小檗堿＝138 859C－53 540，r＝0.999 9，線 性 范 圍 3.094～198.000mg／L；Y鹽酸藥根堿＝138 039C＋48 639，r＝0.999 7，線性范圍0.725～46.400mg／L。結(jié)果顯示：鹽酸小檗堿低、中、高（3.094、24.750、99.000mg／L）3種濃度的回收率分別為 103.1%、98.3%、99.2%，日內(nèi)、日間 RSD均小于1.9%；鹽酸藥根堿低、中、高（0.725、5.800、23.200mg／L）3種濃度的方法回收率分別為103.1%、98.7%、101.2%，其日內(nèi)、日間 RSD 均小于1.9%。二藥回收率及精密度均符合測定要求。

1.6.4 腸循環(huán)液中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿濃度的測定 分別精密吸取一定濃度的對(duì)照品溶液和在不同時(shí)間點(diǎn)取大鼠體內(nèi)腸循環(huán)液100μL于EP管中，加入900μL甲醇，搖勻，于25℃，12 000r／min，離心10min，吸取上清液20μL，注入色譜儀，測定即得。

圖1 空白腸循環(huán)液、對(duì)照品、樣品的HPLC圖Fig.1 The HPLC chart of blank intestinal juice，reference substance and the sample

1.7 大鼠體內(nèi)腸吸收實(shí)驗(yàn)

1.7.1 樣品循環(huán)液的配制 精密稱取黃連粉末（120目）2.5g置于50mL具塞錐形瓶中，加入模擬胃液，37℃攪拌1h，定容，過濾，濾液測定鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿含量分別為3.345、0.760mg／mL，取母液10mL置于100mL容量瓶中，用含酚紅濃度為20mg／L的K-R營養(yǎng)液稀釋至刻度，搖勻，即得黃連粉末樣品液。同時(shí)，分別精密稱取對(duì)照品鹽酸小檗堿167.25mg、鹽酸藥根堿38.00mg置于50mL具塞錐形瓶中，同上法制成鹽酸小檗堿及鹽酸藥根堿樣品液，備用。

1.7.2 大鼠體內(nèi)小腸吸收實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［12］方法。將Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，禁食12h（自由飲水）。用20%烏拉坦溶液麻醉（6mL／kg）后固定在手術(shù)臺(tái)板上，保持（37±0.5）℃的體溫，沿腹中線切開腹部約3cm，結(jié)扎膽總管，在需考察部位（十二指腸上部及回腸下部）的兩端剪開小口，插入硅膠管，扎緊，接好循環(huán)裝置。將插管與恒流泵連接，形成回路。先用（37±0.5）℃的生理鹽水清洗腸段，再用（37±0.5）℃的 K-R 營養(yǎng)液以5 mL／min的流速平衡10min，再以空氣排出K-R營養(yǎng)液，用已預(yù)熱（37±0.5）℃的樣品液以2.5mL／min的流速回流，分別 于 0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h吸取回流液2mL（同時(shí)補(bǔ)充等量的20 mg／L酚紅溶液），經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）過濾，取濾液分別測定藥物和酚紅的濃度。根據(jù)酚紅的濃度計(jì)算出供試液的體積，根據(jù)每一時(shí)間段藥物濃度和供試液體積的變化計(jì)算出腸循環(huán)液中的剩余藥量（X），以lnX對(duì)取樣時(shí)間（t）作圖得一直線，由直線的斜率求出吸收速率常數(shù)（Ka），由2.5h剩余藥量的變化值對(duì)零時(shí)間剩余藥量的比，求出2.5h藥物吸收百分率。以各時(shí)間點(diǎn)吸收率作為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，得出大鼠小腸對(duì)藥物（小檗堿和藥根堿）的吸收曲線。

2 結(jié)果

對(duì)黃連粉末中鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿與等量對(duì)照品在大鼠小腸吸收速率常數(shù)（Ka）及吸收百分率（Pa）進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表1。黃連粉末中鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿吸收百分率與對(duì)照品比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。且黃連粉末中鹽酸小檗堿吸收百分率是對(duì)照品鹽酸小檗堿的近

3.6倍，而對(duì)照品鹽酸藥根堿吸收百分率是黃連粉末中鹽酸藥根堿的近2倍。黃連粉末中鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿與等量對(duì)照品鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿在大鼠小腸中的吸收均在1.5h達(dá)高峰值，在1.5～2.5h達(dá)到平衡，見圖2、3。

表1 黃連粉末中鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿在大鼠小腸的吸收百分率（Pa）和吸收速率常數(shù)（Ka）（±s，n＝6）Table 1 The small intestinal Pa and Ka of berberine and jatrorrhizine fromRhizoma coptidis powder in rats（±s，n＝6）

表1 黃連粉末中鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿在大鼠小腸的吸收百分率（Pa）和吸收速率常數(shù)（Ka）（±s，n＝6）Table 1 The small intestinal Pa and Ka of berberine and jatrorrhizine fromRhizoma coptidis powder in rats（±s，n＝6）

與對(duì)照品比較＊P＜0.01

Ka（h－1）組別Pa（%）92黃連粉末 1.444±0.219 0.391±0.036 30.26±4.38＊ 9.61±1.41鹽酸小檗堿 鹽酸藥根堿對(duì)照品 1.322±0.232 0.402±0.031 8.22±1.10 19.95±2.鹽酸小檗堿 鹽酸藥根堿＊

圖2 黃連粉末中與對(duì)照品中鹽酸小檗堿在大鼠小腸的吸收曲線Fig.2 The small intestinal absorption curve of berberine from Rhizoma coptidis powder in rats

圖3 黃連粉末中與對(duì)照品中鹽酸藥根堿在大鼠小腸的吸收曲線Fig.3 The small intestinal absorption curve of jatrorrhizine from Rhizoma coptidis powder in rats

3 討論

本研究以動(dòng)態(tài)的、仿生的方法，模擬通過胃液的消化后黃連粉末在大鼠小腸中的狀態(tài)，以等量鹽酸小檗堿和鹽酸藥根堿對(duì)照品作為對(duì)照，對(duì)比研究其在小腸中的吸收藥量、吸收率、吸收速率和達(dá)飽和時(shí)間。結(jié)果顯示，黃連粉末中鹽酸小檗堿吸收百分率高達(dá)（30.26±4.38）%，是對(duì)照品鹽酸小檗堿（8.22±1.10）%的近3.6倍，而對(duì)照品鹽酸藥根堿吸收百分率是黃連粉末中鹽酸藥根堿吸收百分率的近2倍，黃連粉末直接服用有利于其所含鹽酸小檗堿在小腸部位的吸收，而不利于鹽酸藥根堿的吸收，且二者的吸收窗在1.5h。

鹽酸小檗堿小腸吸收率較低，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［13］的一致，但是，黃連粉末中鹽酸小檗堿小腸吸收率大幅提高。鹽酸小檗堿作為黃連治療糖尿病主要有效成分，其含量及作用效率遠(yuǎn)高于有效成分鹽酸藥根堿［14］，且該化合物較易溶于熱水而不易溶于冷水，不利于配制成液體制劑，例如，古方中的湯劑。結(jié)合本研究結(jié)果，說明古方黃連以粉末入丸藥治療糖尿病從劑型選擇上具有一定科學(xué)性。

黃連粉末中所含鹽酸小檗堿較對(duì)照品鹽酸小檗堿在小腸部位表現(xiàn)出較佳的吸收，而鹽酸藥根堿與對(duì)照品比較則吸收不佳。這一結(jié)果充分說明黃連所含眾多成分之間，在生物體內(nèi)的吸收相互影響，這也是黃連進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的作用效應(yīng)強(qiáng)于單一同劑量有效成分的原因之一。在中藥分離研究中，許多中藥經(jīng)一步步分離后，療效逐漸降低，這一結(jié)果，一方面與中藥各成分綜合藥效有關(guān)，另一方面也可能與消化道吸收有關(guān)，本研究結(jié)果可以作為較好的實(shí)驗(yàn)佐證。

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