梅州金柚果肉中多酚氧化酶特性的研究

黎 婕，陳 中，林偉鋒

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

柚子(pomelo)是柑橘屬常綠果樹，是典型的熱帶、亞熱帶水果，具有清爽、甘甜、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特等突出特點(diǎn)，并且柚子皮厚耐藏，因此有“天然水果罐頭”的稱號(hào)［1］。柚子成熟后富含糖類，還有抗壞血酸和一些酶類，整體存放的柚子可以維持較常時(shí)間。但是在加工過程和存放過程中，顏色會(huì)逐漸變深嚴(yán)重影響觀感質(zhì)量和產(chǎn)品的商品市場(chǎng)價(jià)值。褐變是柚子加工過程中最容易發(fā)生的現(xiàn)象，褐變一般有兩種:一種是非酶褐變，這種褐變加工品不僅顏色變深，同時(shí)還發(fā)生其他一些生化反應(yīng)，破壞營(yíng)養(yǎng)成分，影響制品風(fēng)味，產(chǎn)品品質(zhì)下降，柚子產(chǎn)品一般會(huì)在高溫滅菌過程中發(fā)生美拉德反應(yīng);另一種是酶促褐變，柚子中的單寧等物質(zhì)在多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)作用下生成褐色產(chǎn)物［2］。本文對(duì)梅州金柚果肉中多酚氧化酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步利用這優(yōu)良資源，科學(xué)控制深加工過程中的酶促褐變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅州金柚 市售;丙酮、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、巴比妥鈉、鹽酸、鄰苯二酚 分析純。

JM－L50膠體磨 溫州市龍灣永興張祥膠體磨廠;UV6100A紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;5418小型高速離心機(jī) 德國(guó)eppendorf有限公司;TC10K電子天平 美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司;B11－2轉(zhuǎn)速數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司

1.2 粗酶液的制備［3］

將柚子去皮、去囊，將一定量柚子肉在膠體磨中打成漿狀，量取 100mL肉漿，加入 200mL丙酮(－20℃)，高速攪拌2min，用布氏漏斗抽濾，濾餅用200mL丙酮(－20℃)再次抽濾，丙酮粉置于蒸發(fā)皿中，用冷風(fēng)將殘留的丙酮吹干，約得丙酮粉12g，置于－20℃下存放。取丙酮粉 1.0g，加入 100mL預(yù)冷(4℃)磷酸緩沖溶液(0.05mol/L，pH6.4)，磁力攪拌30min，高速冷凍離心以5000r/min離心10min，上清液過濾即得PPO粗酶液。

1.3 PPO酶活力的測(cè)定

參比液為2.0mL磷酸緩沖溶液(0.05mol/L、pH6.4)、2mol/L鄰苯二酚1.0mL，搖勻后在60℃水浴中預(yù)熱10min;待測(cè)液為1.5mL磷酸緩沖溶液(0.05mol/L、pH6.4)、2mol/L 鄰苯二酚 1.0mL，搖勻在60℃水浴中預(yù)熱10min，測(cè)定前再加入預(yù)熱(60℃)的PPO粗酶液0.5mL，馬上在422nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定，酶液加入后開始計(jì)時(shí)，每1s記錄一次吸光值OD值，共記錄5min，對(duì)照不加酶液的參比液，酶活性以1min OD值每增0.001為一個(gè)活力單位。

1.4 不同酶促反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)

按照1.3中測(cè)定酶活性方法加入底物及粗酶液，在UV6100A紫外可見分光光度計(jì)下于350～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，連續(xù)掃描待測(cè)液5次，獲得不同酶促反應(yīng)時(shí)間的吸收光譜。每次掃描間隔20s，5次掃描共計(jì)酶催化底物反應(yīng)100s。從5次掃描的吸收光譜中可得到每次掃描時(shí)的最大吸收波長(zhǎng)λmax，及其在此最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度值。

1.5 PPO最適反應(yīng)pH的測(cè)定

配制 pH 為 3、4、5、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、8、9的一系列緩沖溶液，按照1.3中方法測(cè)定不同pH下PPO活性的變化。以最高酶活力為100%，計(jì)算PPO相對(duì)酶活。

1.6 PPO最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

取磷酸緩沖溶液液20mL，鄰苯二酚溶液10mL和 PPO 粗酶液 5mL 分別在 30、40、50、60、70、80、90℃的水浴中保溫10min，按照1.3中的方法測(cè)定不同溫度下PPO活性的變化。以最高酶活力為100%，計(jì)算PPO相對(duì)酶活。

1.7 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系以及PPO米氏常數(shù)Km值的測(cè)定

分別配制濃度為 0.5、1、2、3、3.5、4、4.5 mol/L 的鄰苯二酚溶液，按照1.3中的方法進(jìn)行測(cè)定，比較不同底物濃度下PPO的活性變化。并求出相應(yīng)的反應(yīng)速率(以 ΔA/min來表示)，根據(jù) Lineweaver和 Burk提出的雙倒數(shù)法作圖求出Km和Vmax值。

1.8 PPO的熱穩(wěn)定性研究

取磷酸緩沖溶液液20mL，鄰苯二酚溶液10mL和 PPO 粗酶液5mL 分別在 30、40、50、60、70、80、90、100℃的水浴中保溫30min，馬上冷卻至室溫，再分別在60℃下保溫10min，按照1.3中的方法測(cè)定不同溫度下PPO的穩(wěn)定性。以最高酶活力為100%，計(jì)算PPO相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶促反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)

圖1所示為第1至第5次掃描的吸收光譜。由測(cè)定方法可知，第1至第5次掃描反映了不同酶促反應(yīng)時(shí)間的吸收光譜的變化，每次掃描間隔20s，即第1次掃描結(jié)果是反應(yīng)前20s的吸收光譜，第2次掃描結(jié)果是反應(yīng)第21s至40s的吸收光譜，以此類推。由圖可知，PPO催化的鄰苯二酚反應(yīng)產(chǎn)物在可見光范圍有一個(gè)明顯吸收峰，且不同時(shí)間掃描得到的吸收光譜特征相似。在第一次掃描所得的λmax為422nm，第5次掃描時(shí)λmax已增加為424nm。這說明隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)物在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)，即λmax在不斷增大，向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向偏移。這是由于PPO能催化鄰苯二酚變成醌，醌進(jìn)一步聚合，最后生成黑色素，醌的進(jìn)一步聚合，無需酶的催化可自動(dòng)進(jìn)行，因此當(dāng)PPO催化生成醌這一產(chǎn)物后，醌會(huì)自動(dòng)進(jìn)一步向結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的黑色素形成方向轉(zhuǎn)化，所以酶促反應(yīng)至一段時(shí)間后，λmax會(huì)不斷增大，向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向偏移［4］。不同來源的PPO，以鄰苯二酚為底物的產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)大部分都在410～420nm范圍 內(nèi)［5］，例如牛蒡?yàn)?410nm［6］，華北落葉松為420nm［7］，蕨菜為 415nm［3］;但也有部分來源的 PPO最大吸收波長(zhǎng)不在此范圍內(nèi)，如荔枝果肉為398nm［8］，紫甘薯為 370nm［9］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得金柚果肉中PPO以鄰苯二酚為底物在422nm處有最大吸光值，所以在之后實(shí)驗(yàn)中均取422nm為其測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 酶促反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of product

2.2 PPO最適反應(yīng)pH的測(cè)定

為了準(zhǔn)確地找出金柚果肉PPO的最適pH范圍，實(shí)驗(yàn)首先在較廣泛pH(3.0～9.0)范圍內(nèi)進(jìn)行，然后在酶活較高的pH(5.8～7.4)范圍內(nèi)再細(xì)分測(cè)定，圖2中只表示出有代表性的點(diǎn)。由圖2可知，金柚果肉PPO酶活性對(duì)環(huán)境酸堿度非常敏感，當(dāng)pH在6.0～6.6范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高活性;當(dāng)pH小于5.0或者大于7.0時(shí)，活性迅速下降;在pH為3.0和9.0時(shí)，PPO活性分別只有最大時(shí)的7.6%和24.6%。其活性在測(cè)定范圍內(nèi)pH變化的趨勢(shì)近似單鐘形，在pH6.2時(shí)酶活最高，在6.0～6.6范圍內(nèi)酶活較高。由此推斷在金柚加工過程中，適當(dāng)控制pH可以抑制酶的活性，也能明顯減輕褐變發(fā)生。這是因?yàn)镻PO的輔基Cu2+，其作用的機(jī)制就在于銅的氧化還原作用，在pH較低的強(qiáng)酸形條件下，酶中的銅離子被解離出來，使酶失去活性，從而防止褐變產(chǎn)生，在pH高的強(qiáng)堿性環(huán)境中，Cu2+轉(zhuǎn)化為沉淀，脫離了酶蛋白，也能使酶失去活性［10］。

圖2 PPO的最適反應(yīng)pHFig.2 The optimum pH for PPO from pomelo

一般來說，各種來源的PPO最適pH都在中性(6.0～7.4)附近［11］，大多在7.0～7.4 范圍。很多文獻(xiàn)都有關(guān)于PPO最適pH的報(bào)道，例如以鄰苯二酚為底物，草莓PPO的最適pH為5.5，蘋果為pH6.0，茄子為 pH7.0，蔥為 pH7.5，大薔薇為 pH8.5 等［12］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得金柚果肉PPO的最適pH范圍為6.0～6.6，與其它來源的PPO較為接近，可在加工過程中采用與其他果蔬類似的方法控制pH。

2.3 PPO最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

圖3為PPO粗酶液和底物分別在不同溫度下處理10min，再混合進(jìn)行測(cè)定的效果圖。由圖3可知，溫度在50～70℃之間金柚果肉PPO活性保持較高值。在溫度較低(20～50℃)時(shí)，隨溫度升高活性增加，在溫度高于70℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活性明顯降低。溫度對(duì)PPO的影響數(shù)雙重的，一方面溫度升高能加快酶催化反應(yīng)速度的進(jìn)程，另一方面促使酶蛋白變性，是兩種作用的綜合［9］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大部分不同來源的PPO最適溫度皆在20～35℃范圍，例如梨為 20℃，葡萄為 25℃，梅子為 37℃等［13］，通常在70℃以上短時(shí)高溫處理即為有效鈍化酶的活性。本實(shí)驗(yàn)所得金柚果肉PPO的最適反應(yīng)溫度與其他來源PPO相似。

圖3 PPO的最適反應(yīng)溫度Fig.3 The optimum temperature for PPO from pomelo

2.4 底物濃度和PPO活性的關(guān)系

由圖4可以看出，底物在低濃度時(shí)(＜1mol/L)，底物濃度和反應(yīng)速率有一定的正比關(guān)系，隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率也相應(yīng)地增加;當(dāng)?shù)孜镞_(dá)到一定濃度(≥2mol/L)，底物濃度再增加，反應(yīng)速率接近平緩，不再具有線性關(guān)系;但底物濃度進(jìn)一步增大(≥3.5mol/L)，吸光值的變化隨著濃度的增大反而降低。說明金柚果肉PPO的最適反應(yīng)底物濃度為2mol/L，再增加底物濃度對(duì)酶的活性作用不大。這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時(shí)，有一些酶的活性部位并沒有與底物結(jié)合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物結(jié)合，使酶促反應(yīng)進(jìn)行，在達(dá)到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結(jié)合，此時(shí)，酶活性部位被底物飽和，進(jìn)一步提高底物濃度也不能提高酶活，酶活力達(dá)到最大值［14］。這個(gè)結(jié)論與Michaelis－Menten假說是相一致的，可根據(jù)Lineweaver和Burk提出的雙倒數(shù)法作圖求出Km和Vmax值。

2.5 PPO熱穩(wěn)定性研究

圖4 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系Fig.4 The relationship between substrate concentration and reaction rate

將粗酶液和底物分別在 30、40、50、60、70、80、90、100℃保溫30min后，再調(diào)至最適溫度60℃測(cè)定PPO活性，得到結(jié)果如圖5。由圖5可知，高于80℃處理的酶液，活性迅速下降，90℃處理30min后，PPO活力只有最大時(shí)的16.8%。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，可采用熱燙處理，降低直至破壞果蔬組織中的PPO活性，從而控制果蔬的酶促褐變。

圖5 米氏常數(shù)的測(cè)定Fig.5 The Lineweaver－Burk plots of enzyme－catalyzed reaction of PPO from pomelo

圖6 PPO的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of PPO from pomelo

3 結(jié)論

金柚果肉中PPO的最大吸收波長(zhǎng)為422nm，最適pH范圍為6.0～6.6。PPO的最適溫度范圍為50～70℃;經(jīng)過PPO的熱穩(wěn)性實(shí)驗(yàn):表明金柚果肉中PPO要經(jīng)過80℃以上處理才開始被鈍化。動(dòng)力學(xué)研究表明，底物濃度與金柚果肉PPO活性的關(guān)系遵循Michealis－Menten的酶促動(dòng)力學(xué)。以鄰苯二酚為底物，在本實(shí)驗(yàn)條件下(pH6.4，60℃)，米氏常數(shù) Km=0.947mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax=0.375U/min。經(jīng)比較，金柚果肉PPO與其他來源PPO的特性基本相似，因此可利用常見的果蔬處理方法來抑制金柚在貯運(yùn)和加工過程發(fā)生的褐變。

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