高密度二氧化碳對牛背最長肌顏色穩(wěn)定性的影響

張巧娜，楊紅菊，高曉光，戴瑞彤，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京100107）

高密度二氧化碳技術(shù)（DensePhaseCarbonDioxide，DPCD）的基本原理是在一定的溫度、壓力和時間條件下，給予處于密閉處理釜的物料高壓CO2處理，形成高壓、高酸環(huán)境，從而殺死物料中的微生物、鈍化內(nèi)源酶[1]，達到延長貯藏期和改良物料品質(zhì)的目的。

近些年來，DPCD作為一種新型冷殺菌技術(shù)備受青睞，很多研究結(jié)果也證實了DPCD具有顯著的殺菌效果，但是處理對肉的色澤造成了不利的影響[2]。肉的色澤主要與肌紅蛋白（Mb）有關(guān)，Mb有三種化學(xué)存在形式：還原型肌紅蛋白（DeoMb，暗紫色）、氧合型肌紅蛋白（OxyMb，鮮紅色）和高鐵型肌紅蛋白（MetMb，棕褐色）。在一定的條件下，這三種形式的Mb在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化。姚中峰等[3]研究DPCD處理能使肉由紅色逐漸變成灰棕色，顯著提高L*值（p＜0.05）、降低a*值（p＜0.01），并且4℃冷藏7d后，與對照組相比，DPCD處理能提高肌紅蛋白的穩(wěn)定性。在貯藏期間，MetMb會逐漸積累，肉色變褐，由于屠宰后肉內(nèi)存在的各種酶系還沒有失活，肌肉內(nèi)還在進行著一系列生理生化的反應(yīng)，這些都會影響肉品色澤及Mb的含量與狀態(tài)。戴瑞彤[4]通過對MetMb還原酶與冷卻肉色澤穩(wěn)定性之間的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，肌肉中MRA越高，肉的色澤越穩(wěn)定。有文獻[5]報道線粒體活性高，呼吸耗氧上升，進而降低了氧分壓，促使OxyMb脫氧形成DeoMb，DeoMb穩(wěn)定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色變褐，影響了肉的顏色穩(wěn)定性。本文通過研究DPCD處理對Mb、MRA、線粒體呼吸及相關(guān)其酶系活性等指標的影響，旨在探究經(jīng)DPCD處理后這些指標的變化與顏色穩(wěn)定性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

屠宰后經(jīng)24h冷卻的牛背最長肌 北京御香苑公司；馬心肌紅蛋白、琥珀酸、還原型輔酶I（NADH）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、2，6-二氯酚靛酚（DCPIP）

美國Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA） 拜爾迪生物有限公司；蔗糖、Tris-Base、乙二胺四乙酸（EDTA）等 北京藍弋試劑公司，均為分析純；CO2氣體（純度99.9%） 北京分析儀器公司。

WBN-5/50型高密度二氧化碳殺菌器 溫州貝諾機械有限公司；FA25型均質(zhì)機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；TGL20M型臺式高速冷凍離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司；CR400型色差儀 日本柯尼卡－美能達公司；Evolution 60S型紫外可見分光光度計 Thermo Fisher；OXYGRAPH型液相氧電極 英國漢莎（Hansatech）公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DPCD處理 開機預(yù)熱DPCD設(shè)備30min，開啟風(fēng)箱使得冷凍機組冷卻水箱溫度降低到-5℃左右，每次實驗前在操作控制面板上分別設(shè)定處理壓力（7、14、21、28、35MPa），開啟恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)，處理釜溫度升溫至25℃并保持穩(wěn)定。

取屠宰后經(jīng)24h冷卻的背最長肌。在無菌操作條件下，去掉牛背最長肌的筋膜及可見的脂肪，切成5cm×3cm×1cm的肉片，擺在鏤空肉架上置于處理釜中，密封后泵入CO2，經(jīng)過5～10min的升壓過程達到設(shè)定壓力，保持恒壓20min。處理時間達到后，取出樣品，真空包裝后放于0～4℃冰箱備用。

1.2.2 色澤的測定 取肉樣，用手持色差儀直接測量色澤，每組樣品選取5～8個點進行測量。

1.2.3 肌紅蛋白含量的測定 采用Tang[6]的方法，用分光光度計法進行MetMb相對百分含量的測定。

1.2.4 高鐵肌紅蛋白還原酶活性（MRA）的測定

1.2.4.1 樣品中MetMb還原酶粗酶液的提取 高鐵肌紅蛋白還原酶活力的測定，按照Mikkelsen的方法[7]，稍有改動。取肉樣10g加入20mL 4℃磷酸鹽緩沖液（2.0mmol/L，pH7.0），4℃下均質(zhì)1min，均質(zhì)液在4℃下，10000r/min離心20min，上清液經(jīng)濾紙過濾除去脂肪，濾液中OxyMb用稍過量的高鐵氰化鉀氧化后，再用冰的磷酸鹽緩沖液（2.0mmol/L，pH7.0），4℃下透析24h，期間換液三次，透析完畢后，12000r/min離心20min（4℃），取上清液作為MetMb還原酶粗酶液。

1.2.4.2 MRA的測定 還原酶的活性用分光光度法測定。配制標準反應(yīng)混合物，成分見表1（pH6.4，溫度為25℃），空白對照以水代替NADH，其他組分不變。反應(yīng)由加入NADH起始，用紫外可見分光光度計記錄波長580nm的吸光值。依照Mikkelsen的方法[7]，MetMb還原酶的活性用每毫升提取液在1min內(nèi)580nm下吸光值變化來表示。在此波長下OxyMb與MetMb的吸光值相差最大，兩者的摩爾消光系數(shù)為12×103L·mol-1·cm-1。通過反應(yīng)前后（在反應(yīng)線性階段）光吸收值的變化，便可計算出MRA活性。每個樣品重復(fù)三次，取平均值。

表1 高鐵肌紅蛋白還原酶活力測定的標準反應(yīng)混合物Fig.1 Reaction substances of metmyoglobin reductase activity

1.2.5 線粒體的提取 線粒體的提取參考Zhu[8]的方法。

1.2.6 琥珀酸脫氫酶（SDH）活力的測定 參照文獻[9]的方法，配制標準反應(yīng)物，成分如表2所示，反應(yīng)溫度為25℃，對照組以去離子水代替琥珀酸鈉溶液，其他組分不變。用去離子水校零，測定反應(yīng)溶液在600nm處的吸光值。加完反應(yīng)溶液，立即混合均勻并開始計時，持續(xù)記錄5min的A600，以獲得適當?shù)姆磻?yīng)速率。每個樣品的酶活力測定重復(fù)三次，取平均值。SDH活力的計算公式如下：

SDH活性單位：1U=A600/min=ΔA600/（Δt×0.01）

SDH的比活力[U/（mg蛋白質(zhì)·min）]=ΔA600/（Δt×0.01）/蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）/0.2×3.0

式中，ΔA600：反應(yīng)直線段吸光值的改變量；Δt：直線段反應(yīng)時間（min）。

表2 琥珀酸脫氫酶活力測定的反應(yīng)物組分Fig.2 Reaction substances of succinic dehydrogenase activity

1.2.7 耗氧率（OCR）的測定 耗氧率的測定依據(jù)Kaplan的方法[10]，稍有改動。首先分別在4℃和25℃校正氧電極，用高濃度、現(xiàn)用現(xiàn)配的連二亞硫酸鈉校正零氧線，然后用去離子水清洗反應(yīng)室12次以上。再用OC緩沖液（70mmol/L蔗糖、0.002mmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl、5mmol/L K2HPO4，pH7.4）沖洗幾次，向反應(yīng)室中加入1mL OC緩沖液，蓋好反應(yīng)室蓋子。開啟轉(zhuǎn)子，開始記錄氧含量，等待2min使氧含量平穩(wěn)。取肉樣5g絞碎混勻在50mL去離子水中，測試時加入1mL肉樣液加入反應(yīng)室，立即計時，記錄5min內(nèi)的呼吸速率，即為肉的OCR（nmol/（g meat·min）。

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件進行單因素方差分析（ANOVA）分析；數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差進行記錄，顯著性水平p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPCD處理對色澤的影響

從表3中看出，隨著壓力的升高，L*值大體呈上升趨勢，原因可能是壓力的升高，一方面使肉表面纖維結(jié)構(gòu)更疏松、汁液溶出量增加；另一方面高壓使CO2擴散進入肉中后，與水結(jié)合形成H2CO3并部分水解成H+和HCO3-，使肉的pH降低，蛋白質(zhì)發(fā)生變性和凝集程度增加，肉的保水性下降進而造成更多的水分損失，損失的水分附著在肉的表面使肉的亮度值增加[11]。DPCD處理對a*值有顯著影響（表4），隨著壓力的升高，a*值呈下降趨勢，Choi等[2]認為a*下降的原因是肌漿蛋白中的蛋白變性對肉的紅度起到遮掩作用，因此影響了肉的紅度值和亮度值。隨著貯藏時間的延長，L*值上升，a*值下降，可能是由高鐵肌紅蛋白的積累所導(dǎo)致。對照組中L*值和a*值變化的幅度顯著大于處理組，可以得出DPCD處理保持了L*和a*的穩(wěn)定性。DPCD處理雖對牛肉的色澤造成了影響，但卻提高了牛肉在貯藏期間的顏色穩(wěn)定性。

2.2 DPCD處理對肌紅蛋白含量的影響

由表5～表7可知，隨著壓力的升高，DeoMb和OxyMb的含量下降，MetMb的含量上升，原因可能是隨著壓力的升高，CO2濃度升高，排出的O2越多，造成氧分壓降低。低氧分壓會導(dǎo)致Mb部分變性，從而使其失去保護血紅素的生理功能[12]，失去了保護的Fe2+就會自動氧化成Fe3+，生成褐色的MetMb。MetMb含量與a*成負相關(guān)性，這與Carlez等的研究結(jié)果是一致的[13]。在貯藏期間，可以明顯的看出處理組尤其是壓力高的處理組中的三種形式Mb含量的變化速度顯著低于對照組，從而可以得出DPCD處理使DeoMb、MbO2和MetMb的含量相對趨于穩(wěn)定，說明DPCD處理過程中CO2壓力的提高能增大肌紅蛋白三種氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定性，從而也增大了牛肉色澤的穩(wěn)定性。

表3 DPCD處理對牛肉及貯藏期間亮度值L*值的影響Table 3 Effect of DPCD treatment on L*value of chilled beef during storage

表4 DPCD處理對牛肉及貯藏期間紅度值a*值的影響Table 4 Effect of DPCD treatment on a*value of chilled beef during storage

表5 DPCD處理對牛肉及貯藏期間DeoMb含量百分比的影響（%）Table 5 Effect of DPCD treatment on DeoMb content percentage of chilled beef during storage（%）

表6 DPCD處理對牛肉及貯藏期間OxyMb含量百分比的影響（%）Table 6 Effect of DPCD treatment on OxyMb content percentage of chilled beef during storage

表7 DPCD處理對牛肉及貯藏期間MetMb含量的影響（%）Table 7 Effect of DPCD treatment on MetMb content percentage of chilled beef during storage（%）

表8 DPCD處理對牛肉及貯藏期間MetMb還原酶活性的影響（nmolMMb reduced/min）Table 8 Effect of DPCD treatment on MetMb reductase activity of chilled beef during storage（nmolMMb reduced/min）

表9 DPCD處理對牛肉及貯藏期間琥珀酸脫氫酶活性的影響（U/（mg pro·min））Table 9Effect of DPCD treatment on succinate dehydrogenase activity of chilled beef during storage（U/（mg pro·min））

2.3 DPCD處理對MRA活性的影響

由表8看出，隨著壓力的升高，MRA活性下降。但是7MPa處理組與對照組并沒有顯著差異，而當壓力大于14MPa的各處理組，與對照組相比酶活性顯著降低（p＜0.05），這可能是由于肉的pH較低所致，Zhu等[14]報道pH顯著影響MetMb的還原作用，尤其是當pH＜6時，低pH降低了MRA的還原能力。隨著時間的延長，MRA逐漸降低。有文獻報道，MetMb還原酶在冷藏的一定階段對肉色的穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用，在冷藏的前3d，肉色可能主要由氧分壓、OCR及MetMb還原酶等聯(lián)合控制；在第3～7d，MetMb還原酶起主導(dǎo)作用[15]。

2.4 DPCD處理對SDH活性的影響

SDH是反映線粒體功能的標志酶之一，其活性一般可作為評價線粒體活性的指標。由表9看出，隨著壓力的升高，SDH的活性降低。原因可能有：一方面，隨著壓力的增大，肉的pH下降，低pH影響線粒體的結(jié)構(gòu)和活性；另一方面，壓力對線粒體結(jié)構(gòu)造成一定的物理性傷害。許多學(xué)者[16-17]都提出了低pH是造成線粒體結(jié)構(gòu)完整性和功能性下降的主要原因。本實驗中，隨著貯藏時間的延長，對照組和處理組線粒體的活性都呈下降的趨勢，Tang[18]研究了牛心肌線粒體的完整性和活性，在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)宰后2h線粒體保持結(jié)構(gòu)的完整；96h后，大多出現(xiàn)碎片，大液泡使線粒體腫大，形態(tài)不再完整。在本實驗中，對照組中牛肉的色澤穩(wěn)定性低于處理組，表8中的數(shù)據(jù)正好支持了色澤穩(wěn)定性差的而線粒體活性高的結(jié)論。

2.5 DPCD處理對OCR的影響

由表10可以看出，隨著壓力的升高，耗氧率下降。隨著貯藏時間的延長，對照組和處理組的耗氧率都呈下降的趨勢，這與Lanari[19]在文獻中的報道是一致的：在貯藏期間，耗氧率隨時間的變化是顯著的（p＜0.05）。經(jīng)過DPCD處理的牛肉在貯藏期間顏色穩(wěn)定性好于對照組，其耗氧率低于對照組，即呼吸強度高的肉顏色穩(wěn)定性差。O’Keeffe等[20]得出OCR與MetMb的積累速度呈顯著正相關(guān)；線粒體活性高，呼吸耗氧上升，進而降低了氧分壓，促使OxyMb脫氧形成DeoMb，DeoMb穩(wěn)定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色變褐，進而縮短了肉的顏色貨架期[5]。

表10 DPCD處理對牛肉及貯藏期間耗氧率的影響（nmol/（g meat·min））Table 10Effect of DPCD treatment on oxygen consumption rate of chilled beef during storage（nmol/（g meat·min））

3 結(jié)論

本實驗研究了DPCD處理對牛肉的顏色穩(wěn)定性的影響。隨著壓力的提高，a*、OxyMb含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活、琥珀酸脫氫酶活、耗氧率降低，L*、MetMb含量升高?？梢奃PCD處理對牛肉的色澤造成了不利的影響，使肉紅度值降低，但是DPCD處理卻提高了牛肉在貯藏期間的顏色穩(wěn)定性。因此若想在肉品工業(yè)生產(chǎn)中推廣這一技術(shù)，降低DPCD處理對肉色的影響，需要采取護色技術(shù)，防止其對顏色的不利影響。

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