芥末油殼聚糖復配對蜜桔采后病原菌的抑制作用研究

費湘?zhèn)?，桑衛(wèi)國

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波315211；2.寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江寧波315211）

蜜桔，屬于蕓香科，和釉子、橙子、花椒、枳同屬一科，其維生素C含量是蘋果的6～20倍。蜜桔采摘后的自然壽命為1～2周，經(jīng)過化學防腐處理之后，在常溫下可貯藏一個月左右，但質量劣化迅速，喪失固有甜味?；瘜W防腐劑由于長期連續(xù)的在水果貯藏中應用造成了藥物的高毒高殘留問題，這越來越受到消費者們的關注。蜜桔在采后貯藏期間的主要病害為青霉病和綠霉病。目前普遍采用的抑菌保鮮方法為涂膜保鮮，殼聚糖是主要的涂膜材料，但由于涂膜成分單一，且物質本身并沒有殺菌作用，存在一定的不足。而在成膜物質中另外添加殺菌劑（如植物精油），可以達到改善膜的機械性能，提高涂膜對果蔬的防腐保鮮能力[1-3]。芥末油作為一種天然的植物精油，是以黑芥子或者白芥子經(jīng)榨取而得來的一種調(diào)味汁，具有強烈的刺激味，其主成分為異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate），含量在90%以上。有文獻研究表明，異硫氰酸烯丙酯具有抑菌活性，可以達到抑菌目的。且相對于果蔬采后的其他病原菌如灰霉菌，鏈格孢以及炭疽病菌，芥末油對青霉菌的抑菌效果最好[4-9]。本實驗以新鮮采摘下的蜜桔為實驗對象，殼聚糖作為成膜劑，輔以芥末精油，復配制成可食性的復合保鮮液，對蜜桔進行涂膜處理，研究其對采后貯藏期間病原菌的抑菌作用及貯藏效果。這不僅為蜜桔的貯藏研發(fā)一種新型的、綠色的保鮮方法，也為天然植物的提取物在果蔬采后保鮮上的應用提供借鑒和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥末精油 Sigma-aldrich公司，94%的Allyl isothiocyanate；供試蜜桔 新鮮采摘，從果園直接托運至實驗室，挑選成熟度、大小相對一致，無病蟲害，表面無機械損傷的果實，進行簡單處理[10]；腐敗菌 從已發(fā)霉腐敗的蜜桔中分離純化而得，菌懸液用0.9%生理鹽水稀釋，借助血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌生理鹽水調(diào)整至一定菌數(shù)的孢子懸浮液；殼聚糖 CTS，食品級，脫乙酰度≥90%；冰乙酸 分析純，乙酸含量99.5%。

BX51型系統(tǒng)顯微鏡 日本OLYMPUS公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；磁力攪拌器 上海青浦滬西儀器廠；電子稱 上海鼎源衡器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌保鮮液的復配 果實貯藏效果實驗中，經(jīng)過預實驗果實處理后感官分析，芥末油濃度為40、80、120μL/mL的復合液涂膜處理后，果實表面芥末油氣味人體可接受。先以1%的冰醋酸作溶劑，配成1%的殼聚糖溶液。殼聚糖完全溶解，無分層現(xiàn)象出現(xiàn)。再在1%的殼聚糖溶液中加入芥末精油，于磁力攪拌器上快速攪拌均勻，配成一定芥末油濃度的復配液。抑菌效果實驗中，由于高濃度的芥末油對青霉菌的抑菌效果極強，經(jīng)過前期預實驗及文獻參考，配制成芥末油濃度為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125μL/mL的低濃度梯度的復合液。菌絲生長抑制實驗中，為了抑菌圈的明顯，經(jīng)預實驗分析，分別配成芥末油濃度為1.25、2.5、5.0、10、30μL/mL的復合液。

1.2.2 腐敗菌的分離純化及鑒定 取貯藏期間的腐敗蜜桔，用接種環(huán)挑取少量孢子菌絲于新鮮PDA培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從形態(tài)上觀察各菌落，挑選疑似菌落（綠色菌落，菌落周圍長有白色菌絲），進一步接種劃線至另一新PDA培養(yǎng)基上，如此連續(xù)培養(yǎng)，直至得到純化菌種，并進行電鏡觀察。純化出的菌種接種至斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱中保存。

1.2.3 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定 參照文獻[11]的方法，最低抑菌濃度（MIC）的測定：用無菌吸管吸取各不同芥末油濃度的復配液1mL，分別注入無菌培養(yǎng)皿中，倒入9mL無菌培養(yǎng)基，輕輕混勻待冷卻成含抑菌劑的雙碟平皿，編號。再用無菌移液槍頭取測試菌懸液100μL于雙碟平皿表面，涂布均勻，每個處理三個平行。置26℃恒溫箱中，培養(yǎng)48h，觀察測試菌的生長情況。以完全沒有菌絲生長的芥末油濃度作為該抑菌劑的最低抑菌濃度（MIC）。

最低殺菌濃度（MBC）的測定：將上述沒有長菌的雙碟平皿繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察測試菌的生長情況。以完全沒有菌絲生長的芥末油濃度作為該抑菌劑的最低殺菌濃度（MBC）。

1.2.4 對菌絲生長活性的影響 用無菌移液槍頭取1mL一定稀釋倍數(shù)（10-4）的菌懸液與9mL無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中混勻，待5min凝固后，在培養(yǎng)基上分別放置浸有單殼聚糖液，1.25、2.5、5.0、10、30μL/mL芥末油的復配液的無菌圓濾紙片（直徑6mm），另設蘸取無菌水的濾紙片作為空白組，每皿4個平行點。各處理組均置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5d后，用量尺測量透明圈的直徑大小。每個處理三次重復，取平均值，計算標準偏差。并應用SPSS 19.0 One-Way ANOVA（p=0.05）進行方差分析，比較同一因素不同處理之間的差異顯著性。

1.2.5 樣品抑菌實驗 將擦凈的果實直接分別進行40、80、120μL/mL的不同芥末油濃度復配液的涂膜處理，同時設置不作任何處理的自然條件下的果實作為對照組，所有果實均裝入聚乙烯塑料薄膜袋中，置于20℃溫度，相對濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中貯藏，每隔7d測一次各組的重量及查看果實的腐爛級別及個數(shù)，并計算失水率及腐爛指數(shù)。

1.2.6 測定指標及方法 抑菌圈直徑測量：采用量尺測量。腐爛指數(shù)[12]：根據(jù)果實腐爛程度將果實分級：0級—無腐爛；1級—輕微腐爛，但腐爛部分小于1/10；2級—腐爛部分為1/10～1/6；3級—腐爛部分為1/6～1/4；4級—全部腐爛1/4～1/2；5級—全部腐爛1/2～3/4；6級—全部腐爛。

腐爛指數(shù)＝∑（各級果數(shù)×腐爛級數(shù)）/（總果數(shù)×最高腐爛級數(shù)）

失水率的測定[13]：重量法。

失水率（%）＝（貯藏前重量－貯藏后重量）/貯藏前重量×100

2 結果與分析

2.1 腐敗菌的鑒定

從貯藏中的發(fā)霉的蜜桔上刮取菌絲，通過連續(xù)的分離純化，掃描電鏡下觀察其菌絲形態(tài)，如圖1所示。梗的頂端不膨大，但具有可繼續(xù)再分的指狀分枝，形如掃帚狀，稱為帚狀體。

每枝頂端有2～3個瓶狀細胞，其上各生一串分生孢子；分生孢子為圓形，橢圓形或短柱形，光滑或粗糙。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征并查閱文獻資料鑒定其為青霉屬[14]—指狀青霉（Penicillium digitatum）。

圖1 腐敗菌的電鏡形態(tài)觀察（70×）Fig.1 Electron microscopy morphology of corrupt bacteria（70×）

2.2 芥末對蜜桔采后腐敗菌的抑制作用

2.2.1 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定 芥末油處理后的菌株在26℃恒溫箱中的培養(yǎng)情況見表1。根據(jù)菌絲的生長情況確定最低抑菌濃度及最低殺菌濃度。

前期預備實驗表明，采用0.025、0.050、0.075、0.100、0.125五種芥末油濃度進行腐敗菌的抑菌實驗。由表1中可以看到，經(jīng)過48h的培養(yǎng)，含芥末油的培養(yǎng)基均無菌落生長，可以得出芥末精油殼聚糖復配液對青霉菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.025μL/mL。再進行48h的培養(yǎng)，當芥末油濃度為0.075μL/mL時，無菌落生長，可知芥末精油殼聚糖復配液對青霉菌的最低殺菌濃度（MBC）為0.075μL/mL。

表1 不同芥末油濃度的復配液對腐敗菌的抑制效果Table 1 Inhibitory activity of different mustard oil concentration of the mixed liquid on corrupt bacteria

表2 不同芥末油濃度的復配液對霉菌的菌絲生長的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of different mustard oil concentration distribution of liquid on the mycelium growth of mold

2.2.2 對病原菌菌絲生長活性的影響 經(jīng)以下5個不同芥末油濃度的復配液及單殼聚糖對病原菌處理后，26℃恒溫箱中培養(yǎng)。每隔2d測一次各組抑菌圈的直徑大小。其對病原菌的抑菌效果見表2。

通過對不同貯藏時期各組別之間的抑菌圈直徑大小進行單因素方差分析，結果見表2。當貯藏2d時，1.25、2.5μL/mL的芥末油復配液處理組與殼聚糖對照組相比，其抑菌效果沒有顯著性差異（p>0.05）；而5、10、30μL/mL的芥末油復配液處理組分別與殼聚糖組及低濃度的芥末油復配液處理組之間抑菌效果有差異性顯著（p<0.05）。貯藏4d，各芥末油處理組與殼聚糖對照組對病原菌的抑菌效果均有顯著性差異（p<0.05）；且在不同濃度的芥末油復配液處理組之間，10、30μL/mL分別與1.25、2.5、5μL/mL的芥末油處理組之間抑菌效果有顯著性差異（p<0.05）。而當貯藏6d，高濃度（10、30μL/mL）的芥末油復配液處理組與2.5μL/mL沒有顯著性差異（p>0.05）。由此可分析：當貯藏達到一定時期，芥末油對病原菌的抑菌效果并不是隨著芥末油的濃度增大而增強。且在不同貯藏時期，10μL/mL的芥末油處理組與30μL/mL的芥末油處理組對病原菌的抑菌效果差異均不顯著（p>0.05），這可能是由于高濃度芥末油的藥害作用所導致的。

2.2.3 芥末油對蜜桔貯藏保鮮效果的影響 蜜桔在室溫條件下貯藏期間，由于空氣溫度及濕度的影響，會使果實水分蒸發(fā)，使正常的代謝發(fā)生紊亂，重量下降，出現(xiàn)皺縮等現(xiàn)象。過度的水分蒸發(fā)作為一種脅迫還會刺激果蔬中乙烯和脫落酸的合成，從而加快果蔬的成熟衰老進程，而引起果蔬抗病性降低。各組的失水率效果見圖2，腐爛指數(shù)見圖3。

從圖2中可以看出，與對照組相比，芥末油處理組的失水率比較平緩。在貯藏14d后，處理組與對照組的失水相差明顯，自然貯藏的蜜桔在第21d左右失水率高達13.24%，而芥末油濃度為80μL/mL的復合液處理組的失水率僅為3.42%。當貯藏28d后，芥末油處理組的失水率均高于對照組，這可能是由于對照組在20℃的溫度下貯藏時間過長，已嚴重失水，果實外殼變硬，果實內(nèi)部水分喪失，此時已經(jīng)不能給微生物病原菌提供生長環(huán)境，成一個干殼，以致果實的腐爛指數(shù)也幾乎降至為0（見圖3），這種情況下計算失水率已經(jīng)沒什么意義。在貯藏后的第7d觀察，芥末油處理組的腐爛指數(shù)基本都要高于對照組。這主要是因為在貯藏前進行處理時，由于對處理組的表面刷涂，果實表面未及時成膜或表面生水未干，生水通過表皮滲入果實內(nèi)部，引起病菌感染，從而導致腐爛指數(shù)高于對照組。但在第7～14d左右期間，相對于對照組，芥末油處理組對果實的腐爛指數(shù)急劇下降。而在第14d之后，處理組的腐爛指數(shù)變化趨勢相對平穩(wěn)，基本在0.07左右。從以上兩圖可綜合分析，在20℃的貯藏條件下，芥末油殼聚糖的復配液對蜜桔進行保鮮處理，同自然條件下貯藏相比，貯藏一個月左右，其保鮮效果明顯。若降低貯藏溫度，芥末油處理組對蜜桔的保鮮效果可能更明顯，這需要進一步的研究。

圖2 20℃條件下不同芥末油濃度的復合液對蜜桔涂膜處理后果實失水率的影響Fig.2 The effect of different concentrations of mustard oil compound liquid treatments on the fruit water loss rate under the condition of 20℃

圖3 20℃條件下不同芥末油濃度的復合液對蜜桔處理后果實腐爛指數(shù)圖Fig.3 The effect of different mustard oil concentration of the compound fluid on fruit rot index under the condition of 20℃

3 結論

本實驗通過利用天然植物精油芥末油的主要成分異硫氰酸烯丙酯的抗菌性，結合殼聚糖的成膜性，對蜜桔進行涂膜保鮮處理。實驗結果表明，芥末油殼聚糖的復合液對青霉菌屬—指狀青霉的抑菌效果明顯，芥末油的最低抑菌濃度為0.025μL/mL，當芥末油濃度為0.075μL/mL時，可完全殺死青霉病原菌。

貯藏實驗中，蜜桔在20℃的條件下貯藏，通過對蜜桔的失水率及腐爛指數(shù)進行綜合分析，得出當芥末油濃度為40～80μL/mL時的復合液對蜜桔處理可以達到有效的保鮮效果，其失水變化趨勢線較平緩，失水率較小，腐爛指數(shù)也較低，約0.07左右。但芥末油的濃度越高，其對蜜桔的保鮮效果反而不好，這可能由于高芥末油濃度的毒害作用所影響。綜上分析，對于蜜桔貯藏保鮮，芥末油濃度為40～80μL/mL是比較理想的抑菌濃度范圍，即可達到一定的抑菌效果，在失水及腐爛指數(shù)兩方面分析，貯藏效果也很明顯，且其濃度范圍在感官上均為人體所接受。這也為下一步的蜜桔貯藏保鮮及各生理指標測定提供有利的參考依據(jù)。但實驗仍有一些問題有待解決，如芥末精油能抑菌而又不會影響水果的品質特性的確切濃度；高濃度芥末精油的毒害作用研究；對于芥末精油對蜜桔的保鮮處理，可以有哪些處理方式，這些都將是下一步需深入研究的方向。

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