外源乙烯和茉莉酸甲酯對鮮切甘藍(lán)活性氧代謝的影響

馬 杰，胡文忠，畢 陽，姜愛麗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

甘藍(lán)富含維生素和微量元素，具有良好的保健功能，與胡蘿卜、花椰菜并稱為“防癌三劍客”。國外的食用方法主要是將其制成方便、環(huán)保的沙拉，供人們休閑娛樂的甜點(diǎn)。但鮮切甘藍(lán)在具有方便性和可食性的同時(shí)，卻破壞了甘藍(lán)組織的完整性，擾亂了甘藍(lán)的生理代謝。例如，產(chǎn)生大量活性氧分子，對植物造成氧化傷害，加速植物的衰老進(jìn)程。

目前，國內(nèi)外已對鮮切果蔬的保鮮方法進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)熱水處理[1]、降低果蔬的貯藏溫度[2]以及利用乳酸鈣[3]、抗壞血酸[4]及殼聚糖[5]等抗氧化物質(zhì)處理鮮切果蔬均可通過誘發(fā)組織抗性，從而延長生鮮產(chǎn)品的貨架期，而乙烯[6]和MeJA作為信號分子在鮮切葉菜類蔬菜上的應(yīng)用還不多。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯在植物生長發(fā)育許多過程中均起到重要作用，除可調(diào)控果實(shí)的成熟、種子的萌發(fā)外，乙烯還可在應(yīng)對植物的生物脅迫、非生物脅迫過程中起到重要作用。植物遭受傷害后誘導(dǎo)乙烯合成[7]。研究發(fā)現(xiàn)，鮮切蘋果的乙烯生成量急劇增加，達(dá)到高峰后逐漸下降[8]。1-MCP和1-MCP、乙烯結(jié)合處理相比，經(jīng)過10μL/L乙烯處理可提高鮮切西瓜的呼吸速率，誘導(dǎo)其軟化[9]。JAs作為內(nèi)源信號分子參與植物在機(jī)械傷害、病蟲害等條件下的抗逆反應(yīng)，可誘導(dǎo)啟動植物體內(nèi)的抗性防御基因的表達(dá)，同時(shí)將創(chuàng)傷或傷害的信息傳遞到植物的其他部位使系統(tǒng)產(chǎn)生抗性，進(jìn)而調(diào)控植物的連鎖防御反應(yīng)[10-11]。除此之外，外源應(yīng)用JA和MeJA也能激發(fā)植物的抗性基因——pin基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物發(fā)生化學(xué)防御[12]。本實(shí)驗(yàn)采用外源乙烯和MeJA處理鮮切甘藍(lán)，觀察鮮切甘藍(lán)活性氧代謝的變化以及兩種信號分子在鮮切甘藍(lán)活性氧代謝中的作用，為進(jìn)一步完善豐富鮮切果蔬的加工與保鮮技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘藍(lán) 購于大連開發(fā)區(qū)樂購超市，選擇葉片新鮮且無機(jī)械損傷，無病蟲害，顏色、大小基本一致的葉菜做試材，購買后立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理；過氧化氫、l-蛋氨酸（MET）、氮藍(lán)四唑（NBT）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、聚乙烯吡咯烷酮、亞硝酸鉀、冰醋酸、核黃素、丙酮、濃氨水、濃硫酸、四氯化鈦、濃鹽酸、愈創(chuàng)木酚、95%乙醇、硼酸、硼砂、L-苯丙氨酸、EDTA、β-巰基乙醇、乙酰溴、乙烯利、MeJA 分析純。

Lamda-25型紫外可見分光光度計(jì) 美國PE；SIM-F140型制冰機(jī) 日本三洋；BR4i型臺式高速冷凍離心機(jī) 法國Jouan；T-25型勻漿器 德國IKA；電熱恒溫水浴鍋 上海精宏；超低溫冰箱 青島海爾；Mettler-Toledo型電子分析天平 北京瑞利儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉菜處理方法 將葉菜用清水清洗后，切割成1cm×2cm條狀，將樣品于10μL/L乙烯利溶液（相當(dāng)于4μL/L乙烯，以雙蒸水為溶劑）浸泡10min，以雙蒸水中浸泡相同時(shí)間的樣品作對照，瀝干后各處理的樣品分別裝在經(jīng)過紫外線殺菌的PE塑料淺盤中，25～30μm聚乙烯保鮮膜密封包裝。包裝好的樣品置于4℃的冷庫中貯藏，分別于0、1、2、4、8、12h測定各生理生化指標(biāo)。每處理每指標(biāo)用樣品10g，重復(fù)3次。

1.2.2 O2-·產(chǎn)生速率的測定 參照王愛國和羅廣華的方法[13]并作修改。取10.0g甘藍(lán)樣品，加入10mL 100mmol/L磷酸緩沖液（pH6.4，含0.1%PVPP），在冰浴條件下勻漿后于4℃下10000×g、離心30min。取上清液1.0mL，加入1mL 50mmol/L磷酸緩沖液（pH6.4）和1.0mL 1mmol/L鹽酸羥胺溶液，反復(fù)搖勻后于25℃條件下保溫1h。之后分別加入17mmol/L對氨基苯磺酸溶液1.0mL和7mmol/L α-萘胺溶液1.0mL，混勻后再于25℃保溫20min進(jìn)行顯色反應(yīng)。測定顯色液在波長530nm處的OD值，以不進(jìn)行保溫1h的測定為參比空白進(jìn)行調(diào)零。重復(fù)三次。結(jié)果以μmol/g表示。

1.2.3 H2O2含量的測定 參照Prochazkova的方法[14]并修改。取10.0g甘藍(lán)樣品，加入10mL冷丙酮，冰浴勻漿后于4℃下10000×g離心20min。取100μL上清液，加入100μL 20%的四氯化鈦溶液（溶于濃鹽酸，V/V）和200μL濃氨水，混勻反應(yīng)5min后離心15min。沉淀部分用冷丙酮洗滌4次以減少色素的干擾，最后將沉淀溶于1.5mL 1mmol/L H2SO4溶液中，于410nm測定溶液的吸光度值。按此法作H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線。H2O2含量以μmol/gFW表示。

1.2.4 SOD活性的測定 參照Oberley and Spitz的方法[15]并修改。取10.0g甘藍(lán)樣品，加入10mL 100mmol/L磷酸緩沖液（pH6.4，含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）和1%PVPP），冰浴條件下勻漿后于4℃下、10000×g離心30min，取上清液用于酶活性測定。取5mL指形管4支，2支為測定管，另2支為對照管，依次加入900μL 50mmol/L磷酸緩沖液、1.5mL130mmol/L甲硫氨酸（MET）溶液、0.3mL 750μmol/L氮藍(lán)四唑（NBT）溶液、0.3mL 100μmol/L EDTA溶液+20μmol/L核黃素、100μL粗酶液。其中對照2支管以緩沖液代替酶液，混勻后將1支對照管置于暗處，其他各管于4000 LUX日光燈下反應(yīng)15min。至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光管做空白參比，于560nm處分別測定其他各管的吸光度值。SOD活性以0.5△OD560/min·g Fw表示。樣品重復(fù)測定3次。

1.2.5 POD活性的測定 參照Venisse J S的方法[16]并作修改。稱取10.0g甘藍(lán)樣品，加入10mL 100mmol/L磷酸提取緩沖液（pH6.4內(nèi)含1%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），1mmol/L聚乙二醇，1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），0.01%TritonX-100（V/V）），冰浴條件下勻漿，4℃、10000×g離心30min，取上清液為粗酶液提取液。POD反應(yīng)體系為2.5mL 0.025mol/L愈創(chuàng)木酚、0.2mL 0.25mol/L H2O2和0.2mL粗酶液。加酶液后1min開始記錄反應(yīng)體系每分鐘的吸光值變化，連續(xù)測定2min。在470nm處測定2min內(nèi)樣品的吸光值。POD活性以△OD470/min·g Fw表示。樣品重復(fù)測定3次。

1.2.6 CAT活性的測定 參照Clairbone的方法[17]并修改。稱取10.0g甘藍(lán)樣品，加入10mL 100mmol/L磷酸提取緩沖液（pH6.4，含1%PVPP）在冰浴條件下勻漿，之后于4℃、10000×g條件下離心30min，收集上清液，即為粗酶提取液。反應(yīng)體系包括2mL 10mmol/L H2O2（用50mmol/L、pH6.4的磷酸緩沖液配制）和100μL粗酶液。在240nm處測定2min內(nèi)樣品的吸光值。CAT活性以0.01△OD240/min·g Fw表示。樣品重復(fù)測定3次。

1.2.7 APX活性的測定 參照Nakano和Asada方法[18]并修改。稱取10.0g甘藍(lán)組織，加入10mL 100mmol/L磷酸緩沖液（pH6.4，含1mmol/L EDTA和1%PVPP），冰浴條件下勻漿后于4℃、10000×g離心30min，收集上清液。酶促反應(yīng)體系由2mL 100mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5，含1mmol/L EDTA），0.8mL 3mmol/L抗壞血酸，100μL粗酶液和0.5mL 0.5mmol/L H2O2組成，最后加入H2O2啟動酶促反應(yīng)。從啟動后15s開始記錄反應(yīng)體系在290nm的吸光度值，連續(xù)測定2min。酶活性表示為0.01△OD290/min·g Fw。樣品重復(fù)測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)O2·-產(chǎn)生速率的影響

在生物氧化系統(tǒng)中，氧作為一個(gè)重要的電子受體，在得到不同電子后形成不同的氧化產(chǎn)物，如O2-·、H2O2、·OH等，O2-·和H2O2隨果蔬的成熟而不斷積累[19]。由圖1可知，甘藍(lán)鮮切O2-·生成速率逐漸增加，4h達(dá)到最大值33.57μmol/g之后緩慢回落至初始水平，MeJA處理將O2-·生成速率的峰值提前至鮮切2h，同時(shí)峰值也略低于對照2.33μmol/g。與之不同，乙烯處理對O2-·生成速率的抑制作用較明顯，12h內(nèi)均低于對照，鮮切4h差異最大，低于對照17.667μmol/g?；钚匝鮋2-·作為對組織產(chǎn)生氧化損傷的主要自由基，其含量的大量積累可誘導(dǎo)鮮切產(chǎn)品的品質(zhì)大大降低，因此降低鮮切果蔬的O2-·生成速率是延長鮮切果蔬產(chǎn)品的貨架期的重要目標(biāo)之一，由圖1可發(fā)現(xiàn)，外源乙烯處理可有效抑制鮮切甘藍(lán)中的O2-·生成速率，從而延緩氧化損傷。

圖1 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)O2-生成速率的影響Fig.1 Effects of ethylene and MeJA on the formation rate of O2-in fresh-cut cabbage

2.2 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)H2O2含量的影響

H2O2是啟動衰老的重要因子，H2O2的積累會引發(fā)植物的程序化死亡[20]，甘藍(lán)在鮮切12h內(nèi)H2O2含量呈單峰型變化，于鮮切2h達(dá)到含量高峰1789μmol/g Fw之后緩慢下降，乙烯和MeJA兩種處理均可有效抑制鮮切12h內(nèi)甘藍(lán)中的H2O2含量。與乙烯處理相比，MeJA處理對鮮切甘藍(lán)H2O2含量的抑制效果更明顯（p＜0.05），鮮切2h差異達(dá)到最大，低于對照35.7%。H2O2含量的變化由POD、APX以及CAT等抗氧化物酶的活性以及O2-的含量密切相關(guān)，由圖2可知，MeJA可通過降低鮮切甘藍(lán)的H2O2含量，調(diào)控鮮切甘藍(lán)的活性氧代謝。

圖2 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)H2O2含量的影響Fig.2 Effects of ethylene and MeJA on content of H2O2of fresh-cut cabbage

2.3 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)SOD活性的影響

SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，清除細(xì)胞中多余的O2-·[21]，其活性的提高可增強(qiáng)植物體的抗性、降低活性氧對組織的氧化損傷，保持組織的正常代謝。甘藍(lán)在鮮切12h內(nèi)SOD活性呈先顯著下降又緩慢上升的變化趨勢，乙烯和MeJA兩種信號分子對甘藍(lán)組織中SOD活性的影響不同，MeJA處理抑制鮮切甘藍(lán)的SOD活性，而乙烯處理可有效提高鮮切甘藍(lán)的SOD活性，鮮切2h顯著高于對照62%（p＜0.05）。SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，其主要功能是清除細(xì)胞中多余的O2-·，防止對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害。由圖1可知，乙烯處理可顯著降低鮮切甘藍(lán)的O2-·生成速率，這與圖3顯示的乙烯處理提高鮮切甘藍(lán)的SOD活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

圖3 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)SOD活性的影響Fig.3 Effects of ethylene and MeJA on SOD activity of fresh-cut cabbage

2.4 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)POD的影響

CAT、POD、APX也是植物體內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶，各抗氧化物酶的相互作用可以使體內(nèi)自由基維持在一個(gè)較低水平[22]。其中，CAT與APX的不同之處在于：前者不需要還原力且具有較高的酶活速率，但對H2O2的親和力較弱，后者需要還原性底物，并對H2O2具有較高的親和力[23]。甘藍(lán)的POD活性在鮮切1h達(dá)到高峰后緩慢降低，鮮切4h又呈上升趨勢，并于12h達(dá)到最大值。乙烯和MeJA處理后鮮切甘藍(lán)的POD活性在12h內(nèi)均低于對照（圖4），12h差異達(dá)到最大，經(jīng)過乙烯處理12h后的甘藍(lán)樣品POD活性低于對照54.1%。POD一方面可以作為細(xì)胞膜的保護(hù)酶，清除H2O2，減少其對細(xì)胞膜脂的傷害；另一方面可利用H2O2釋放出的O2氧化酚類物質(zhì)，引發(fā)褐變。由圖4可知，兩種信號分子處理12h內(nèi)，鮮切甘藍(lán)的POD活性均低于對照，雖然對于鮮切甘藍(lán)膜質(zhì)傷害的抑制作用很小，但可以在一定程度下減緩鮮切甘藍(lán)的感官品質(zhì)。

圖4 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)POD活性的影響Fig.4 Effects of ethylene and MeJA on POD activity of fresh-cut cabbage

2.5 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)CAT活性的影響

CAT與POD都是植物體內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶，兩者相互作用可以使體內(nèi)自由基維持在一個(gè)較低水平。由圖5可知，甘藍(lán)鮮切12h內(nèi)CAT活性呈單峰型變化，鮮切處理1h達(dá)到活性高峰后有所回落，外源乙烯和MeJA處理抑制了鮮切甘藍(lán)的CAT活性，同時(shí)，MeJA、乙烯兩種處理差異不大。結(jié)合圖4可知，乙烯和MeJA對鮮切甘藍(lán)的CAT和POD這兩種以H2O2為底物的催化酶均起到抑制作用，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

圖5 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)CAT活性的影響Fig.5 Effects of ethylene and MeJA on CAT activity of fresh-cut cabbage

2.6 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)APX活性的影響

APX是以抗壞血酸為電子供體的專一性強(qiáng)的過氧化物酶，能催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化-還原反應(yīng)，APX活性的升高也有利于植物體內(nèi)H2O2的清除。甘藍(lán)鮮切12h內(nèi)APX活性呈先降后升再降的往復(fù)變化趨勢，外源乙烯處理提高了APX活性，在第8h時(shí)差異達(dá)到最大，高于對照49.1%，與之不同，MeJA處理在貯藏前期促進(jìn)了APX的作用，而在貯藏后期對鮮切甘藍(lán)的APX活性起到抑制作用（圖6）。對比兩種信號分子，乙烯對鮮切甘藍(lán)的自由基清除方面的作用更明顯。

圖6 乙烯和MeJA處理對鮮切甘藍(lán)APX活性的影響Fig.6 Effects of ethylene and MeJA on APX activity of fresh-cut cabbage

3 結(jié)論

新鮮蔬菜在鮮切加工處理過程中產(chǎn)生的機(jī)械傷害誘導(dǎo)鮮切產(chǎn)品產(chǎn)生大量活性氧，這些活性氧誘發(fā)植物組織的正常生理生化代謝紊亂。本研究結(jié)果表明，外源乙烯處理抑制了鮮切甘藍(lán)中的O2-·生成速率，經(jīng)過外源乙烯處理使鮮切甘藍(lán)在貯藏后期其H2O2的含量顯著降低（p＜0.05），同時(shí)使抗氧化物酶SOD、APX活性有所提高，而另兩種以H2O2為底物的抗氧化物酶——POD和CAT的活性受到抑制。與乙烯處理不同，經(jīng)過MeJA處理可誘發(fā)鮮切甘藍(lán)中O2-·生成速率的高峰提前出現(xiàn)，此外H2O2含量也顯著下降（p＜0.05），同時(shí)SOD、POD、CAT活性受到抑制，而鮮切甘藍(lán)的APX活性在貯藏前期呈上升趨勢，貯藏后期酶活受到抑制。APX作為以抗壞血酸為電子供體的專一性強(qiáng)的過氧化物酶，通過催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化-還原反應(yīng)，從而清除植物體內(nèi)活性氧H2O2。MeJA在貯藏前期誘導(dǎo)鮮切甘藍(lán)的APX活性，結(jié)合POD、CAT活性受到抑制，初步推測，APX在清除鮮切甘藍(lán)的活性氧H2O2過程中起到至關(guān)重要的作用。至于MeJA抑制H2O2產(chǎn)生的具體機(jī)理如何，有待進(jìn)一步研究。

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