柱層析循環(huán)法聯(lián)合提取臍橙皮中橙皮苷與多糖的工藝研究

韓寒冰，周 天，劉杰鳳，馬 超，王 穎

（廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東茂名525000）

臍橙是蕓香科柑橘屬甜橙類（Citrussinensis L.Osbeck）中的一個(gè)栽培品種，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所必需的多種營(yíng)養(yǎng)成分。由于臍橙果皮中含有果膠、類黃酮、香精油、色素和多糖等多種有效成分[1-2]。隨著種植面積和規(guī)模的迅速擴(kuò)大，占臍橙果重20%的果皮也成為具有巨大開發(fā)潛力的資源。其中橙皮苷（Hesperidin，C28H34O15）是臍橙果皮中最主要的類黃酮，藥理研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[3-4]。多糖具有清除自由基和抗氧化作用，在抗腫瘤、抗肝炎、抗心血管和抗衰老等方面有獨(dú)特的生物活性，而且對(duì)細(xì)胞毒性極低[5-7]，因此具有極高的藥學(xué)價(jià)值。

近年來(lái)，對(duì)類黃酮物質(zhì)和多糖的提取常用索氏提取法、超聲波和微波輔助提取法[6-9]，但以上方法都普遍存在工藝都比較復(fù)雜、提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑用量大、分離純化程序復(fù)雜等缺陷。另外，這些方法都只孤立地考慮提取其中的一種功能成分，必定造成材料和溶劑的浪費(fèi)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，柱層析循環(huán)法已廣泛應(yīng)用于天然植物有效成分的提取和分離，具有溶劑消耗量少、提取效率高、處理時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。本研究采用柱層析循環(huán)法對(duì)臍橙皮的橙皮苷和多糖進(jìn)行聯(lián)合提取，確定影響效果的主要因素和分離優(yōu)化工藝條件，為有效地提取臍橙皮的橙皮苷和多糖開辟了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臍橙 從本地商場(chǎng)購(gòu)買江西產(chǎn)新鮮臍橙，剝下果皮剪成黃豆粒大小，50℃烘箱中烘至恒重，材料經(jīng)粉碎，過(guò)40目篩得到等于或小于40目（或≤380μm）的粉末作提取用；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（No.110722-200810，純度≥98%）；HPLC用甲醇 色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)的Fisher Scientific公司；其他試劑 分析純。

LC-20A型高效液相色譜儀、LC-20AT型UV檢測(cè)器 日本島津公司；DL-6000型低速冷凍大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2550型紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ5200B型超聲波清洗器 江蘇省昆侖山市超聲儀器有限公司；XYFD-8L型冷凍干燥機(jī) 上海欣諭儀器有限公司。

1.2 橙皮苷和多糖含量測(cè)定

1.2.1 HPLC法測(cè)定橙皮苷含量 色譜柱為YMC ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相A為甲醇，B為1%冰醋酸水溶液，A∶B=35∶65（v/v）。流速1.0mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)283nm，進(jìn)樣量10μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取橙皮苷對(duì)照品若干，用甲醇溶解配制成1mg/mL的橙皮苷對(duì)照品溶液，用40%乙醇稀釋成一系列的濃度梯度：25、50、75、100、125、150μg/mL，分別進(jìn)行液相色譜分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量 測(cè)定多糖用苯酚硫酸法[13]，以葡萄糖為對(duì)照品，用純水配成梯度濃度分別為10、20、30、40、50、60μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 聯(lián)合提取橙皮苷和多糖的工藝條件

1.3.1 選擇溶劑配比 把乙醇和水配制成體積比分別為10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8，0∶10。稱取臍橙皮粉末0.5g 6份，分別加入相應(yīng)配比的溶劑5mL，室溫內(nèi)搖床振蕩（200r/min）1h，6000r/min低溫離心10min，分別檢測(cè)橙皮苷和多糖的含量。

1.3.2 確定吸漲率和浸泡時(shí)間 稱取0.5g臍橙皮粉末12份，并列2組，分別加入40%乙醇或水5mL，室溫內(nèi)搖床振蕩（200r/min），浸泡時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4、5h，到時(shí)取出，6000r/min低溫離心10min，分別測(cè)定上清液體積，用總體積（5mL）減去上清液體積，計(jì)算1g材料吸收溶劑量（mL），即吸漲率；分別測(cè)定上清液中橙皮苷或多糖的含量，確定目標(biāo)物質(zhì)在相應(yīng)溶劑中溶解達(dá)到平衡的浸泡時(shí)間。

1.4 柱層析法提取橙皮苷和多糖

1.4.1 柱層析法分別提取橙皮苷和多糖 選取直徑為1.5cm的玻璃層析柱，臍橙皮粉末5g，40%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）濕樣上柱，保持乙醇溶液沒過(guò)樣品，室溫靜置2h，以吸漲體積（25mL）為一個(gè)收集單位（即一份），以每小時(shí)收集一份的流速進(jìn)行收集，共收集3份，殘?jiān)?jīng)超聲1h，抽濾再得到一份提取液，分別測(cè)定各份橙皮苷的含量。同樣方法，用純水上樣，收集3份水提取液和1份殘?jiān)崛∫海ǜ?5mL），分別測(cè)定各份多糖的含量。

1.4.2 柱層析循環(huán)法聯(lián)合提取橙皮苷和多糖 橙皮苷與多糖的提取連續(xù)進(jìn)行，首先提取橙皮苷，方法與分別提取橙皮苷的相同，不同的是當(dāng)收集完第1份40%乙醇洗脫液（25mL）后，提取液換為純水，再收集第2份洗脫液（25mL），相當(dāng)把柱內(nèi)的乙醇溶液收集完畢。繼續(xù)添加水，連續(xù)收集2份水洗脫液（各35mL）。只保留各提取液中的第1份，第2份提取液由于濃度較低，均作為下一輪的第1份提取液，如此重復(fù)循環(huán)，共用4根層析柱進(jìn)行。分別合并各輪中第1份醇和水提取液，測(cè)定橙皮苷和多糖含量，計(jì)算各輪第1份的提取率。

1.5 橙皮苷與多糖的分離

實(shí)驗(yàn)放大100倍，每份臍橙皮粉500g，選擇4根直徑為8cm的層析柱，作放大循環(huán)實(shí)驗(yàn)，方法與1.4.2項(xiàng)下相同。合并4根柱第1份醇提取液10L和水提取液14L，共24L。減壓濃縮為2L，加8L無(wú)水乙醇，充分搖勻，冰箱4℃靜置過(guò)夜，6000r/min低溫離心10min，傾出上清液，沉淀再用2L水溶解，加8L無(wú)水乙醇，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，合并上清液。橙皮苷溶在上清液中，沉淀為粗多糖，分別測(cè)定橙皮苷和多糖的含量。

1.6 橙皮苷和多糖的純化

將1.5項(xiàng)下中上清液減壓濃縮到1L，回收乙醇，濃縮液中橙皮苷析出，低溫高速離心，傾去上清液，沉淀用1L水洗，靜置離心，傾去上清液，重復(fù)水洗2次，沉淀為橙皮苷的粗產(chǎn)品。測(cè)定粗產(chǎn)品中橙皮苷的含量，并計(jì)算得率。將粗產(chǎn)品充分溶于熱水中，置冰箱4℃靜置1周，經(jīng)布氏漏斗抽濾，去掉水液和雜質(zhì)，用純水反復(fù)沖洗濾紙上的結(jié)晶，抽干后連同濾紙置烘箱中烘干，待產(chǎn)品與濾紙分離后，測(cè)定產(chǎn)品的總重量及橙皮苷的含量，計(jì)算結(jié)晶的純度和得率。結(jié)晶產(chǎn)品重結(jié)晶，計(jì)算重結(jié)晶的純度和得率。

將粗多糖重溶于水中，80%乙醇沉淀，冰箱4℃靜置過(guò)夜，6000r/min低溫離心10min，得沉淀再重復(fù)沉淀一次，沉淀經(jīng)冷凍干燥（-50℃，20Pa）得多糖粉末，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算多糖的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物橙皮苷HPLC分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線

臍橙皮中的橙皮苷含量較高，橙皮苷在283nm有最大的吸收峰[14]，HPLC色譜圖見圖1，圖1中樣品主峰與對(duì)照品橙皮苷的相對(duì)保留時(shí)間均為14.979min，峰形一致，因而可用橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定樣品中的橙皮苷含量。

圖1 橙皮苷HPLC色譜圖Fig.1 Analysis of hesperidin by HPLC

圖2是橙皮苷和多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橙皮苷含量的回歸方程為：y=1706x-1801（R2=0.9998），說(shuō)明線性關(guān)系良好，線性范圍在25～150μg/mL之間。多糖含量的回歸方程為y=0.0101x-0.0086（R2=0.9991），線性范圍在10～60μg/mL之間。

圖2 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線和多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard solution curves of hesperidin and polysaccharides

2.2 提取工藝條件

橙皮苷易溶于乙醇，難溶于水，從圖3（A）可以看出，醇水比為4∶6時(shí)的提取率最高，多糖在醇的溶解性很低，易溶于水，從圖3（B）可以看出，純水的多糖提取率最高，隨著醇水比值的增大，多糖提取率下降。醇水溶液有效地提取橙皮苷的同時(shí)，也把部分多糖提取出來(lái)，以水的提取率為100%來(lái)計(jì)算，醇水比為4∶6溶液的多糖提取率為16.6%。另一方面，在水有效提取多糖的同時(shí)，也把部分橙皮苷提取出來(lái)，大約相當(dāng)醇水最大提取率的1/3。因此，在柱層析法聯(lián)合提取過(guò)程中，首先采用醇水比為4∶6的乙醇溶液為橙皮苷的洗脫液，再以純水作為多糖的洗脫液，對(duì)層析柱中的材料進(jìn)行連續(xù)洗脫，能夠高效地把橙皮苷和多糖提取出來(lái)。

圖3 醇水比例對(duì)橙皮苷和多糖提取效率的影響Fig.3 Affect of proportion of ethanol and water on the extraction rate of hesperidin and polysaccharides

材料對(duì)不同的溶劑的吸收性能有所不同，從圖4可以看出，材料浸泡1h后吸收量均達(dá)到最大。乙醇溶液和水的吸漲率分別接近5倍和7倍（mL/g），因此，乙醇溶液和水提取液分別以5倍體積和7倍體積為1份作一個(gè)收集單位。

圖4 40%乙醇和水的吸漲率Fig.4 Imbibed rate of 40%ethanol and water

經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的浸泡，溶液中橙皮苷或多糖的含量變化見圖5，在2h橙皮苷和多糖的含量均達(dá)到最大，增加浸泡時(shí)間，含量也不再增大，說(shuō)明浸泡2h后，目標(biāo)成分在相應(yīng)的溶劑中已充分溶解達(dá)到平衡。因此，可以確定材料在層析柱中浸泡時(shí)間為2h。

圖5 浸泡時(shí)間的測(cè)定Fig.5 Determination of soaking time

2.3 分別和聯(lián)合循環(huán)提取橙皮苷和多糖的效率

圖6 分別提取橙皮苷和多糖的提取率Fig.6 Extraction rate of hesperidin and polysaccharides by Independent

分別提取橙皮苷和多糖的提取率見圖6，以3份提取液和殘?jiān)暮靠偤涂醋魇悄繕?biāo)成分的總含量，無(wú)論是橙皮苷或多糖，第1份和第2份相加的提取率均超過(guò)99%，因此在收集洗脫液時(shí)，只需要收集第1、2份。

從圖7中可看出，聯(lián)合循環(huán)提取時(shí)，第一輪第一份橙皮苷和多糖的提取率分別為92.7%和90.2%，從第二輪開始，第一份的提取率均達(dá)99%以上。因此，每輪兩成分的提取液均只需保留第一份作為分離純化用，第二份作為下輪的提取液，如此循環(huán)，可減少溶劑量，而且得到的是濃度較大的提取液，大大地提高了提取效率。

圖7 循環(huán)聯(lián)合提取橙皮苷和多糖的提取率Fig.7 Extraction rate of hesperidin and polysaccharides by combined cycle

2.4 橙皮苷和多糖的分離純化結(jié)果

通過(guò)循環(huán)提取，合并乙醇溶液和水提取液的第1份，濃縮后，用醇沉淀，一次性把兩種成分分離開來(lái)，再作后續(xù)的純化，結(jié)果見表1。

臍橙皮中橙皮苷和多糖的含量分別是4.85%和1.93%，循環(huán)提取率達(dá)到99%以上，醇沉分離得到的橙皮苷粗產(chǎn)品中橙皮苷含量為60.27%，多糖粗產(chǎn)品中多糖的含量為15.42%，得率分別是95.45%和97.58%。橙皮苷粗產(chǎn)品為暗灰色粉末，水中放冷結(jié)晶為淡黃色懸浮狀，用純水沖洗抽濾，烘干得白色帶黃粉末，純度92.56%，得率94.78%，第2次結(jié)晶得淡黃色結(jié)晶，純度97.84%。粗多糖經(jīng)過(guò)兩次的水溶和醇沉，最終多糖純度達(dá)到85.32%。

表1 橙皮苷和多糖的含量、純度、提取率和回收率Table 1 Content，purity，extraction rate and recovery rate of hesperidin or polysaccharid

3 結(jié)論與討論

橙皮苷的常用提取方法有乙醇提取法[15]、“堿提酸析”法[16]和水浸超聲輔助法[8]等，醇提法和堿提法都可用超聲強(qiáng)化提取過(guò)程。有關(guān)橙皮苷的結(jié)晶工藝的報(bào)道較少，各文獻(xiàn)報(bào)道的最佳提取工藝條件也差別很大。荊瑞勇等[6]提取臍橙皮多糖時(shí)，料液比1∶40，提取時(shí)間3h，提取溫度95℃，顯然，提取溫度高，時(shí)間長(zhǎng)，多糖有效成分容易失活，提取液用量大，不利于多糖的分離和純化。柱層析法原理是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)上的差異（如分子形狀、大小、極性、親和力和分配系數(shù)等），使各組分以不同濃度分布在兩相（固定相和流動(dòng)相）中，并以不同速度移動(dòng)，最終分離純化各組分[17]。柱層析循環(huán)法的工藝簡(jiǎn)單，溶劑用量少，并可通過(guò)用不同極性的溶劑連續(xù)把橙皮苷和多糖提取出來(lái)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，通過(guò)柱層析聯(lián)合循環(huán)提取時(shí)，用5倍體積的40%乙醇和7倍體積的水就能把臍橙皮中99%以上的橙皮苷和多糖提取出來(lái)。如果分別用乙醇溶液和水提取橙皮苷和多糖時(shí)，兩種洗脫液中均包含橙皮苷和多糖，需各自將兩種成分分離開來(lái)，工藝繁雜，效率低，成本增加。柱層析循環(huán)法可避免分別分離純化兩種組分，而是在常溫條件下，使用乙醇溶液和水連續(xù)對(duì)臍橙皮粉末洗脫，每輪兩成分的提取液只需保留第1份作為分離純化用，第2份作為下輪的洗脫液，如此循環(huán)，洗脫液合并，醇沉淀多糖，一次性把它們分離開來(lái)。因此，循環(huán)聯(lián)合提取既節(jié)省大量溶劑，同時(shí)也減少后續(xù)的濃縮工序，成本低，功能成分損失少，效率高，是一個(gè)適合聯(lián)合提取并分離橙皮苷和多糖的方法。

[1]蔡定建，謝志鵬，羅六保，等.臍橙皮中黃酮類化合物與果膠的分離和提取研究[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2006，12（4）：239-242.

[2]劉小華，李舒梅，董明華，等.臍橙功效成分提取與質(zhì)量檢測(cè)研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：138-140.

[3]陸蓓，壽文虹，趙建英.柑橘黃酮中總黃酮及橙皮苷的含量測(cè)定[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（1）：44-45.

[4]Mokbel MS，Hashinaga F.Evaluation of the antioxidant activity of extracts from buntan（Citrus grandis Osbeck） fruit tissues[J].Food Chemistry，2006，94（4）：529-534.

[5]侯秀娟，沈勇根，徐明生，等.化橘紅多糖的提取純化及抗氧化活性研究[J].中國(guó)釀造，2012，31（9）：135-138.

[6]荊瑞勇，王麗艷，張躍文.從臍橙皮中提取可溶性多糖工藝條件研究[J].食品科學(xué)，2009，30（8）：90-92.

[7]董宏坡，江明樹，朱偉杰.化橘紅多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中成藥，2010，32（3）：49-493.

[8]朱思明，于淑娟，楊連生，等.陳皮中橙皮苷的超聲法提取與結(jié)晶[J].食品工業(yè)科技，2005，26（6）：131-134.

[9]宋茹，韋榮編.微波法萃取柑桔皮多糖的研究[J].糧油食品科技，2008，16（2）：24-26.

[10]Ni H，Zhou XH，Li HH，et al.Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster medium[J].Journal of Chromatography B，2009，877（22）：2135-2141.

[11]Wang L，Gong LH，Chen CJ，et al.Column chromatographic extraction and separation of polyphenols，caffeine and theanine from green tea[J].Food Chemistry，2012，131：1539-1545.

[12]Zhan PY，Zeng XH，Zhang HM，et al.High-efficient column chromatographic extraction of curcumin from Curcuma longa[J].Food Chemistry，2011，129（2）：700-703.

[13]DuBois M，Gilles KA，Hamilton JK，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Chem，1956，28（3）：350-356.

[14]朱玉昌，周大寨，王成.甜橙皮中橙皮苷提取工藝[J].食品科學(xué)，2010，31（22）：264-267.

[15]談安群，吳厚玖，王華，等.索氏法與超聲波輔助提取甜橙橙皮苷比較研究[J].中成藥，2012，12（6）：80-87.

[16]朱思明，于淑娟，扶雄.橙皮苷提取方法的研究[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（7）：17-20.

[17]文赤夫，李國(guó)章，董愛文，等.橙皮苷的提取及其穩(wěn)定性分析[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2006，40（3）：37-40.