睪酮抑制高鹽喂養(yǎng)下雄性大鼠血管內(nèi)皮生長因子的表達和釋放

王曉慧, 談世進

（1蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部老年醫(yī)學(xué)專業(yè)2010級, 蘇州 215123; 2上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院老年科, 上海 200233）

高鹽負荷下血壓升高的特性被稱作血壓的鹽敏感性，由高鹽引起的血壓升高為鹽敏感性高血壓。雄激素的作用十分廣泛，在心血管系統(tǒng)中起重要作用，在雄性個體中，雄激素的濃度及活性隨年齡的增長而降低[1]。在雄激素中，起主要生理活性作用的是睪酮。筆者之前的研究表明，高雄激素水平可促進高鹽喂養(yǎng)下雄性大鼠血壓的升高，而去勢處理可以降低高鹽喂養(yǎng)所引起的血壓升高幅度[2]。其他學(xué)者的研究也有類似發(fā)現(xiàn)[3]。而雄激素對鹽敏感高血壓的影響機制尚未完全闡明，血管內(nèi)皮在調(diào)節(jié)體內(nèi)心血管生理功能、維持血壓的平衡中起著極其重要的作用，雄激素影響高鹽飲食下大鼠的血壓水平，是否與內(nèi)皮功能的變化有關(guān)，值得關(guān)注。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是主要存在于血管內(nèi)皮中，可特異性地刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的活性肽[4]，推測VEGF作為有效的血管生成因子、內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原和強烈的血管通透因子[5]，其含量的變化可對內(nèi)皮功能產(chǎn)生重要影響。本實驗通過建立高鹽飲食雄性大鼠實驗?zāi)Ｐ?，探討不同水平的睪酮對高鹽飲食下雄性大鼠血管VEGF的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠32只，8周齡左右，體質(zhì)量（200±10）g，由上海西普爾-必凱實驗動物公司提供。

1.2 實驗藥物

丙酸睪酮注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號100404）；氟他胺片（flutamide，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號110902）；鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號101103）。

1.3 主要試劑

大鼠睪酮、VEGF酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Biotech公司）。

1.4 主要儀器

電子稱，自動平衡離心機，高速冷凍離心機（BECKMAN公司），超低溫冰箱（Sanyo 公司，中國），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，型號ELx800），熒光定量PCR儀（FTC3000型），多樣品組織研磨機（凈信科技公司，Tissuelyser-24型）。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗?zāi)Ｐ团c分組 32只雄性Wistar大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組（Sham組），去勢組（Cas組），去勢后補充睪酮組（TC組），去勢后補充睪酮和氟他胺組（FTC組）。每組8只。全部在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后開始實驗。Cas組、TC組及FTC組大鼠均施以去勢手術(shù)。2ml/kg體重鹽酸氯胺酮腹腔注射麻醉后，碘伏消毒陰囊處皮膚，沿縱膈正中切開一縱形切口，剪開鞘膜后，分別將雙側(cè)睪丸與附睪分離并切除睪丸，然后把附睪放回陰囊，青霉素沖洗切口預(yù)防感染，縫合切口。Sham組只睪丸與附睪的分離處理，不做切除，然后放回陰囊，青霉素沖洗并縫合切口。各組大鼠術(shù)后均用2×105U青霉素連續(xù)腹腔注射3d預(yù)防感染。

1.5.2 動物飼養(yǎng)與給藥 手術(shù)后各組均以8%氯化鈉高鹽顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，自由飲用自來水，TC組、FTC組給予丙酸睪酮2mg/kg、皮下注射、隔日1次[6]，其余各組分別以等量的玉米油皮下注射，F(xiàn)TC組同時給予氟他胺1mg/kg、每日1次灌胃，其余組以等量的生理鹽水灌胃。

1.5.3 采集血樣及組織 高鹽飼料喂養(yǎng)8周后取材。氯胺酮2ml/kg腹腔注射麻醉后，剖開胸腔，充分暴露心臟并于右心房處采血，注入普通管，管口封好后放入4℃冰箱中1～2h，然后取出以2500r/min的速度離心10min，分離上清并分裝，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采血后迅速分離并剪取胸主動脈及腹主動脈，生理鹽水沖洗干凈后置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 ELISA法測定血清中睪酮和VEGF濃度 將待測血清樣本置冷水中復(fù)融，采用ELISA法測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.5.5 RT-PCR測定血管內(nèi)皮中VEGF mRNA的表達 按說明抽提總RNA，核酸分析儀測定RNA樣品濃度，A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度高，無蛋白質(zhì)和DNA的殘余。取1.6μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR引物：VEGF上游5′-CCTGGCTTTACTGCTGTACCT-3′，下游5′-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3′；GAPDH上游5′-GACGCTTTGGTGAAGAAACTGA-3′，下游5′-CACACGGCAATAAATGACATGAG-3′。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，對照相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測擴增結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)對目的DNA條帶進行掃描，并采用BandScan 5.0凝膠圖像分析軟件進行吸光度（A）值分析。軟件自動算出每個基因Ct值的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，并計算出mRNA相對于內(nèi)參GAPDH的表達量，以各組VEGF與自身GAPDH吸光度值的比值作為各組細胞中VEGF mRNA的相對含量（M）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以±s表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），滿足方差齊性的多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性的多重比較采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的血清睪酮和VEGF濃度

與Sham組相比，Cas組血清睪酮濃度明顯降低（P＜0.01），TC組差異則無統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)TC組升高近2倍（P＜0.01）。與Sham組相比，Cas組、FTC組大鼠血清VEGF濃度明顯升高（分別為P＜0.01，P＜0.05），TC組大鼠無明顯差異（P＞0.05；表1）。

表1 各組大鼠血清睪酮、VEGF濃度Table 1 Serum testosterone and VEGF contents in rats (n＝8,±s)

表1 各組大鼠血清睪酮、VEGF濃度Table 1 Serum testosterone and VEGF contents in rats (n＝8,±s)

VEGF: vascular endothelial growth factor; Sham group: control group;Cas group: castration group; TC group: testosterone supplement after castration group; FTC group: flutamide-treated testosterone supplemented castrated group.Compared with Sham group, *P＜0.05, **P＜0.01

Group Testosterone(ng/L) VEGF(μg/L)Sham group 3.15±0.54 20.837±13.828 Cas group 0.26±0.02** 47.246±19.733**TC group 2.80±0.30 22.870±12.057 FTC group 5.47±1.29** 46.043±22.070*

2.2 各組大鼠的血管內(nèi)皮中VEGF mRNA表達

與Sham相比，Cas組、FTC組大鼠血管內(nèi)皮VEGF mRNA 表達水平明顯升高（均P＜0.01）；TC組差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖1，圖2）。

圖1 RT-PCR檢測血管內(nèi)皮中VEGF mRNA的含量Figure 1 VEGF mRNA expression in vascular endothelium

3 討 論

眾所周知，高鹽飲食可以對血壓產(chǎn)生重要影響。在此基礎(chǔ)上，既往研究又發(fā)現(xiàn)高鹽誘導(dǎo)下，高雄激素水平對雄性大鼠血壓的升高有促進作用，通過去勢處理降低雄激素水平可相應(yīng)的降低血壓水平。但雄激素在此過程中具體的作用機制尚未完全闡明。

圖2 血管內(nèi)皮中VEGF的相對表達Figure 2 Relative VEGF expression in endothelial cells

Hu等[7]的研究表明，雄激素可能是通過激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin-system，RAS），促進高鹽飲食下大鼠血壓的升高，同時也加重了腎臟的損傷。RAS不是血壓調(diào)節(jié)中唯一起作用的途徑，血管內(nèi)皮在血壓調(diào)節(jié)中也起重要作用。Oloyo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠的主動脈環(huán)對乙酰膽堿的最大舒張效應(yīng)在高鹽飲食下降低，而在去勢處理后升高，如果在去勢的基礎(chǔ)上補充生理劑量的睪酮，舒張效應(yīng)又轉(zhuǎn)為降低，提示雄激素可能通過直接作用于血管內(nèi)皮產(chǎn)生影響。

血管內(nèi)皮是介于循環(huán)血液與血管平滑肌細胞之間的，能夠合成、分泌多種重要血管活性物質(zhì)的生理屏障。VEGF主要存在于血管內(nèi)皮細胞，為特異刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的活性肽，可刺激血管內(nèi)皮細胞分化、移行、增生和管腔形成，是一種強有力的促血管生成因子[4]；可增加血管的通透性及參與新生血管的形成[9]；同時還可以選擇性地增強血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂，刺激內(nèi)皮細胞增殖[10]。因此，VEGF含量的變化可對血管內(nèi)皮的功能產(chǎn)生重要的影響。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，高血壓人群血清VEGF含量明顯高于正常血壓人群[11]。刺激VEGF分泌的因素主要有缺血、缺氧、牽拉、炎癥細胞因子等，其中最主要的為缺血和缺氧。血壓升高導(dǎo)致血管內(nèi)皮局部環(huán)境的缺血、缺氧，刺激VEGF分泌，而VEGF可以促進血管內(nèi)皮細胞的分裂、增殖，同時增加血管的通透性，使血管中過多的水分滲入到組織中，可對高血壓起代償作用。

另一方面，在抗腫瘤藥物的研究中，抑制VEGF信號通路的藥物是最新的抗腫瘤藥物之一，多位學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)該類藥物最明顯的副作用是造成血壓升高[12,13]，也從側(cè)面證明VEGF可對血壓的變化產(chǎn)生有益的代償作用。在本實驗中，雄激素完整組（Sham組和TC組）的大鼠血清VEGF濃度較低，低雄激素水平組（Cas組）的大鼠血清VEGF濃度較高，F(xiàn)TC組雖然睪酮濃度最高，但由于雄激素受體（androgen receptor，AR）阻滯劑氟他胺的作用，睪酮作用不能得到發(fā)揮，故VEGF濃度也較高。同時血管內(nèi)皮中VEGF mRNA的表達也呈現(xiàn)類似的水平。由此推測，雄激素可能抑制了VEGF的表達與釋放，導(dǎo)致VEGF水平降低，因而由高鹽飲食造成的內(nèi)皮損害得不到相應(yīng)的代償性修復(fù)，使血管內(nèi)皮細胞的功能受損。VEGF本身可通過刺激血管內(nèi)皮細胞的分裂、增殖，增加血管壁的通透性等作用對血管內(nèi)皮的功能產(chǎn)生影響，同時有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，VEGF還可調(diào)控一氧化氮合酶的表達而對血管內(nèi)皮產(chǎn)生影響[14,15]。

雄激素發(fā)揮作用主要是通過AR，AR主要位于睪丸間質(zhì)細胞核內(nèi)，也存在于神經(jīng)系統(tǒng)、腎及腎上腺、大部分心房及心室肌、主動脈、冠狀動脈中，這也是雄激素作用廣泛的原因。Lin等[16]最早發(fā)現(xiàn)血管壁中存在AR，血管壁各層均有分布，以內(nèi)層為主。氟他胺是一種非類固醇類抗雄激素藥物，主要通過抑制靶細胞受體對睪酮的攝取和（或）結(jié)合，進而干擾雄激素作用[17]。在本實驗氟他胺組，即使睪酮濃度很高，也不能正常發(fā)揮作用，表明雄激素主要是通過AR發(fā)揮作用。

本研究表明，以睪酮為代表的雄激素可對高鹽飲食大鼠的VEGF水平產(chǎn)生影響，高濃度雄激素可降低VEGF水平，而低濃度則導(dǎo)致VEGF升高，且這種影響是通過AR進行的。但確切的影響機制尚需進一步證實。雄激素可能通過影響VEGF的水平直接影響血管內(nèi)皮功能，這可能是雄激素影響鹽敏感高血壓作用的機制之一。

[1]張春萍, 方寧遠, 康近方.老年人9種性激素的化學(xué)發(fā)光免疫分析[J].中國老年雜志, 2006, 26(8): 1030?1031.

[2]胡劍平, 談世進, 丁在咸.雄性激素在高鹽引發(fā)高血壓中的作用[J].中華高血壓雜志, 2008, 16(11): 991?993.

[3]Yanes LL, Sartori-Valinotti JC, Iliescu R,et al.Testosterone-dependent hypertension and upregulation of intrarenal angiotensinogen in Dahl salt-sensitive rats[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 296 (4): F771?F779.

[4]Breier G, Albrecht U, Sterrer S,et al.Expression of vascular endothelial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell differentiation[J].Development, 1992,114(2): 521?532.

[5]Anteby EY, Greenfield C, Natanson-Yaron S,et al.Vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor and fibroblast growth factor-4 and -10 stimulate trophoblast plasminogen activator system and metalloproteinase-9[J].Mol Hum Reprod, 2004, 10(4): 229?235.

[6]Lin SM, Tsao CM, Tsai SK,et al.Influence of testosterone on autotomy in castrated male rats[J].Life Sci, 2002, 70(20):2335?2340.

[7]Hu J, Tan S, Zhong Y.Effects of testosterone on renal function in salt-loaded rats[J].Am J Med Sci, 2011, 342(1):38?43.

[8]Oloyo AK, Sofola OA, Anigbogu CN.Orchidectomy attenuates impaired endothelial effects of a high-salt diet in Sprague-Dawley rats[J].Can J Physiol Pharmacol, 2011,89(4): 295?304.

[9]Miller JW, Adamis AP, Shima DT,et al.Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor is temporally and spatially correlated with ocular angiogenesis in a primate model[J].Am J Pathol, 1994, 145(3): 574?584.

[10]Vyzantiadis T, Karagiannis A, Douma A,et al.Vascular endothelial growth factor and nitric oxide serum levels in arterial hypertension[J].Clin Exp Hypertens, 2006, 28(7):603?609.

[11]廖貴紅.高血壓患者血清VEGF和ET- 1檢測的臨床意義[J].中國熱帶醫(yī)學(xué), 2007, 7(9): 1616?1619.

[12]Belcik JT, Qi Y, Kaufmann BA,et al.Cardiovascular and systemic microvascular effects of anti-vascular endothelial growth factor therapy for cancer[J].J Am Coll Cardiol, 2012,20(7): 618?625.

[13]Maitland ML, Bakris GL, Black HR,et al.Initial assessment,surveillance, and management of blood pressure in patients receiving vascular endothelial growth factor signaling pathway inhibitors[J].J Natl Cancer Inst, 2010, 102(9):596?604.

[14]Facemire CS, Nixon AB, Griffiths R,et al.Vascular endothelial growth factor receptor 2 controls blood pressure by regulating nitric oxide synthase expression[J].Hypertension, 2009, 54(3): 652?658.

[15]Machnik A, Neuhofer W, Jantsch J,et al.Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism[J].Nat Med, 2009, 15(5): 545?552.

[16]Lin AL, McGill HC Jr, Shain SA.Hormone receptors of the baboon cardiovascular system：Biochemical characterization of myocardial cytoplasmic androgen receptors[J].Circ Res,1981, 49 (4): 1010?1016.

[17]Goldspiel BR, Kohler DR.Flutamide: an antiandrogen for advanced prostate cancer[J].DICP, 1990, 24(6): 616?623.