基于柑橘木虱COⅠ基因的捕食性天敵捕食作用評估

孟 翔，歐陽革成，Xia Yulu，郭明昉，*

(1.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;2.廣東省科學(xué)院，廣州 510070;3.National Science Foundation Center for Integrated Pest Management，North Carolina State University，1730 Varsity Dr.Suite 110，Raleigh，NC 27606，USA)

柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama屬同翅目木虱科，是柑橘黃龍病亞洲種和美洲種唯一的傳播媒介。它取食黃龍病株后可終生帶毒，且傳毒率高［1-5］。目前我國防治柑橘木虱主要采取化學(xué)防治措施，雖然有一定的效果，但頻繁的使用農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境破壞和產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性問題不容忽視［6-7］，因此尋找新的防控方法與途徑是一項(xiàng)迫切的任務(wù)。

目前，天敵群落在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的地位越來越突出，利用天敵防治害蟲已成為熱點(diǎn)。其中節(jié)肢動物捕食者被認(rèn)為是一種控制害蟲種群增長的重要因子［8］。捕食性天敵的利用是有害生物可持續(xù)控制的重要方法之一。在諸多研究捕食性天敵對害蟲捕食效應(yīng)的方法中，常規(guī)的室內(nèi)捕食功能測定和田間捕食效果觀察法［9］不但工作量大，操作過程繁瑣，且試驗(yàn)條件與實(shí)際生態(tài)環(huán)境存在較大差異;而以生化手段的研究方法，如:免疫標(biāo)記(ELISA)、單克隆抗體、同位素與放射性同位素標(biāo)記、蛋白質(zhì)電泳分析［10-12］等，雖然在一定程度提高了檢測的特異性和靈敏度，但其技術(shù)上多具有一定的局限性［13-14］，如:必要的設(shè)備分析、復(fù)雜的抗體制備、環(huán)境和安全的考慮等都限制了捕食作用評價的準(zhǔn)確性。

然而，借助分子生物學(xué)技術(shù) (如:ITS、mtDNA、SCAR和細(xì)胞色素氧化酶(COⅠ、Ⅱ)基因標(biāo)記等)檢測天敵消化道內(nèi)是否含有害蟲殘體［15-16］已經(jīng)成為探明不同生境捕食者-獵物的捕食動態(tài)和頻率，揭示環(huán)境變化對捕食控害能力的影響及其內(nèi)在機(jī)制的主流技術(shù)，這些檢測技術(shù)不僅大大提高了測試的敏感性，且操作簡單，檢驗(yàn)迅速。因此，其已逐步發(fā)展成為昆蟲捕食效應(yīng)研究的有效方法，并被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究［16-17］。

本研究通過COⅠ標(biāo)記法設(shè)計(jì)柑橘木虱特異性片段擴(kuò)增引物，并針對與柑橘木虱同域發(fā)生的其它害蟲:紅蜘蛛、柑橘黑刺粉虱、蚜蟲、卷葉蛾、潛葉蛾等以及捕食性天敵進(jìn)行種特異性檢驗(yàn)和田間主要捕食性天敵的篩選，擬為柑橘木虱捕食性天敵譜的研究提供分子生物學(xué)依據(jù)。同時在室內(nèi)條件下研究龜紋瓢蟲成蟲取食單頭柑橘木虱4齡若蟲或成蟲的消化反應(yīng)，為特定捕食性天敵昆蟲捕食作用的定性與定量檢測提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

柑橘木虱及田間節(jié)肢動物均用網(wǎng)捕、手捕法采自廣東省四會市羅源鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)田，田間常規(guī)管理，期間不施用任何殺蟲劑。

供取食消化實(shí)驗(yàn)的龜紋瓢蟲于實(shí)驗(yàn)田采集后，帶回廣東省昆蟲研究所蟲鼠害生態(tài)控制研究中心養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)(溫度(25±1)℃;光周期L14∶D10;相對濕度:60%—80%)備用。

1.2 DNA的提取

DNA提取采用單頭勻漿法。參考安瑞生等的方法［18］，將單頭蟲用雙蒸水清洗、吸干裝入1.5 mL離心管，加入 50μL 提取緩沖液 A(1%SDS，50 mmol/LTris·Cl，25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA)，-20℃放置 5 min后以研磨棒搗碎，然后用100 μL提取緩沖液沖洗研磨棒;65℃水浴45 min，中間取出混勻2次;加入等體積的提取液B(3 mol/LKAC(pH值7.2))，冰上放置1 h以上;12 000 r/min離心10 min，移上清液于另一離心管中12 000 r/min離心10 min，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，放置-20℃1 h以上;12 000 r/min，離心10 min，收集沉淀，用70%乙醇洗滌1—2次;晾干沉淀;每管加入50μL 0.1×TE，充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 柑橘木虱特異引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)柑橘木虱細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因序列(GenBank:JF509109.1)應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異片段擴(kuò)增引物對A和B，引物對A:上游引物:5'-TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC-3';下游引物:5'-TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA-3'。引物對B:上游引物:5'-CCAAGGAGTAGGAACAGGCTGA-3';下游引物:5'-TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA-3'。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25 μL:Taq DNA 聚合酶 0.5 μL;dNTP 2 μL;10×buffer 2.5 μL;上游引物 1 μL;下游引物 1 μL;DNA 模板 1 μL;ddH2O 17 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 Eppendorf Mastercycler ep基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行，對照反應(yīng)體系中的DNA模板以雙蒸水代替。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個循環(huán);最后72℃延伸5 min;反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為:0.5×TBE(45 mmol/L Tris-硼酸鹽，1 mmol/L EDTA)，以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker作為參照物檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 引物種特異性檢驗(yàn)

以與柑橘木虱同域發(fā)生的節(jié)肢動物(龜紋瓢蟲Propylea japonica;日本刀角瓢蟲Serangium japonicum;紅肩瓢蟲Leis imidiate;小瓢蟲亞屬 Scymnus pullus(sp);麗草蛉幼蟲 Chrysopa sinica;八斑球腹蛛 Theridion octomaculatum;大銀腹蛛Leucauge magnifica;草間小黑蛛Erigonidium graminicolum;斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus;微蟹蛛屬Lysiteles(sp);黑細(xì)長蟻Teraponera nigar;舉腹蟻屬Crematogaster(sp);蚜蟲Aphidoidea sp;柑橘黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus;紅蜘蛛Tetranychus cinnbarinus;卷葉蛾Homona magnanima;稻蝗屬Oxya(sp);紅脊長蝽Tropidothorax elegans;柑橘潛葉蛾P(guān)hyllocnistis citrella;螳螂科Mantidae(sp))饑餓48 h的DNA作為模板，以取食2頭柑橘木虱若蟲的龜紋瓢蟲成蟲作為陽性對照、清水作為陰性對照，分別以引物對A和B進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)COⅠ引物的種特異性，以避免在使用柑橘木虱特異性引物的PCR中出現(xiàn)假陽性。PCR反應(yīng)體系與程序同上。

1.5 田間柑橘木虱捕食性天敵檢測

于2011年10月1日至12月1日柑橘木虱盛發(fā)期每周調(diào)查1次，在樣田內(nèi)隨機(jī)采集捕食性天敵，單頭分裝，-20℃凍存待測。以引物對A檢測捕食性天敵對柑橘木虱的捕食作用。

1.6 消化時間對特異性引物檢測效果研究

以田間采集的龜紋瓢蟲成蟲為實(shí)驗(yàn)材料，龜紋瓢蟲成蟲饑餓處理48 h后，飼喂柑橘木虱4齡若蟲1頭或成蟲1頭。取食柑橘木虱后的龜紋瓢蟲置25℃恒溫下培養(yǎng)，期間只給水，不飼喂任何食物。分別在取食柑橘木虱后 0，1，3，6，12，24，48，72，96 h，單頭提取龜紋瓢蟲成蟲 DNA，用于 PCR。PCR 以引物對 A 作引物，反應(yīng)體系與程序同上。實(shí)驗(yàn)每處理重復(fù)10次，最后統(tǒng)計(jì)出陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物種特異性驗(yàn)證

通過對21種節(jié)肢動物的驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn):引物對A和B對柑橘木虱及取食2頭柑橘木虱的龜紋瓢蟲成蟲(陽性對照)均具有明顯的擴(kuò)增效果，且條帶明顯。所擴(kuò)增片段大小分別約為420 bp和322 bp。其中，引物對A對其它種類無擴(kuò)增作用，物種特異性強(qiáng)。引物對B還分別可以從數(shù)種其他節(jié)肢動物的DNA模板中擴(kuò)增出與目標(biāo)片段相同的PCR產(chǎn)物?？梢娨飳對柑橘木虱不具有特異性。引物對A在試驗(yàn)涉及的物種范圍內(nèi)具有對柑橘木虱的種的特異性，可用于進(jìn)一步試驗(yàn)(圖1)。

圖1 引物對A和引物對B特異性驗(yàn)證的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification of some species in citrus orchards using primers A and primers B

2.2 田間柑橘木虱捕食性天敵檢測結(jié)果

以柑橘木虱田間采集的各種捕食性天敵為對象，應(yīng)用引物對A單頭檢測其對柑橘木虱的捕食作用。結(jié)果表明(表1):在所檢測的8類群20種捕食性天敵中，瓢蟲、草蛉、食蚜蠅、獵蝽、螞蟻等天敵均具有捕食柑橘木虱的能力，其中以龜紋瓢蟲Propylea japonica、斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus、麗草蛉Chrysopa formosa最為明顯，其陽性反應(yīng)比率分別為58.06%，57.89%和48.00%。

2.2 消化時間對特異性引物檢測效果的影響

以引物對A對龜紋瓢蟲成蟲腹內(nèi)的柑橘木虱4齡若蟲和成蟲成分分別進(jìn)行陽性檢測，結(jié)果表明(圖2):在取食后0 h處理的龜紋瓢蟲中均能檢測到柑橘木虱成分，但隨著消化時間的延長，其DNA條帶擴(kuò)增效果降低，陽性比率下降，兩者呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用Probit模型模擬龜紋瓢蟲成蟲取食柑橘木虱4齡若蟲和成蟲的陽性比率與消化時間的關(guān)系，以引物對A進(jìn)行檢測，擬合良好(Chi-Square=0.769，P=0.979;Chi-Square=0.833，P=0.975)，半衰期分別為4.93 h和12.98 h。

表1 柑橘園捕食性天敵對柑橘木虱捕食作用的COⅠ檢測Table 1 The predatory detection of predators based on COⅠgene of Diaphorina citri in citrus orchards

圖2 利用特異性引物對A檢測龜紋瓢蟲成蟲對柑橘木虱捕食的陽性檢出率與消化時間的關(guān)系Fig.2 The relations of Diaphorina citri DNA detection probability and different digestion time in Propylea japonica samples after feeding，using primers A

3 結(jié)論與討論

捕食者-獵物系統(tǒng)是一個復(fù)雜的相互作用系統(tǒng)，是群落生態(tài)學(xué)中的一個重要組成部分，也是進(jìn)行害蟲生物防治和天敵利用的重要科學(xué)依據(jù)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)為研究捕食者-獵物關(guān)系提供了更為有效、準(zhǔn)確的方法。本研究根據(jù)已知柑橘木虱COⅠ基因序列，尋找柑橘木虱不同于其他種的獨(dú)特區(qū)域。針對單一物種設(shè)計(jì)引物通常會受到相近種序列高度相似的干擾［19］。本研究不局限于分子分類學(xué)研究，而是從柑橘園本身的害蟲和天敵種群及其生態(tài)環(huán)境出發(fā)，針對與柑橘木虱同域發(fā)生的近似種及其他害蟲和天敵成功設(shè)計(jì)了柑橘木虱特異性PCR引物，并在田間天敵檢測和室內(nèi)消化檢測中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步明確和豐富了柑橘木虱的主要捕食性天敵種類，表明捕食性天敵是柑橘木虱綜合防治中值得利用的重要天敵資源。可見基于COⅠ基因的分子標(biāo)記方法適合柑橘木虱捕食性天敵的篩選與捕食作用的評估。

在消化道內(nèi)含物的分子分析時，捕食者消化道中獵物殘留DNA的可檢測時間非常重要，其決定了DNA技術(shù)的實(shí)際可行性。如:鱗翅目昆蟲Eupithecia sp的卵被瓢蟲Halmus chalybeus取食后，24 h可檢測率為85%;小菜蛾P(guān)lutella xylostella在姬蝽腸道內(nèi)，16 h可檢測率為67%，在狼蛛Lycosa sp腸道內(nèi)，72 h可檢測率為80%［20-22］。本研究通過PCR陽性反應(yīng)檢測，可以追蹤到龜紋瓢蟲成蟲取食1頭柑橘木虱4齡若蟲或成蟲24 h的可檢測率分別為:10%和30%，其最長檢測時間分別為48 h和72 h。根據(jù)DNA可檢測的時限性，我們可以推測柑橘木虱在田間被龜紋瓢蟲捕食的時間范圍。此外，在自然生態(tài)系統(tǒng)中，由于一些捕食者食性廣泛又具有一定的選擇性，其間接捕食作用會對消化道內(nèi)含物的分子分析和評估造成一定影響。本實(shí)驗(yàn)所研究的龜紋瓢蟲屬于廣食性天敵，其在自然環(huán)境中對柑橘木虱的捕食作用與間接捕食作用的關(guān)系及其影響因素尚有待進(jìn)一步研究。

不同捕食者對同一獵物的消化能力呈較豐富的多樣性。如馬鈴薯甲蟲卵在瓢蟲腸道中的半衰期是7.0 h，在刺肩蝽中的半衰期是50.9 h［23］，而本研究結(jié)果同樣表明同一捕食者(龜紋瓢蟲成蟲)對獵物(柑橘木虱)不同蟲態(tài)的消化能力也呈較豐富的多樣性，龜紋瓢蟲成蟲分別取食1頭柑橘木虱4齡若蟲或成蟲的消化半衰期分別為4.93 h和12.98 h?？梢?，食物鏈DNA跟蹤技術(shù)可在某種程度上闡明龜紋瓢蟲在空間與時間上對柑橘木虱的捕食規(guī)律。

此外，由于昆蟲等是變溫動物，代謝水平隨溫度升高而加速，獵物可被檢出的時間會隨溫度的升高而變短，因此獵物在天敵腸道內(nèi)滯留時間分析時，尚需考慮溫度對變溫動物消化的影響［19］。本試驗(yàn)在室內(nèi)特定條件下進(jìn)行，捕食者和獵物均處于一個簡單的封閉系統(tǒng)內(nèi)，其生存條件和自然條件存在很大差異。對生活在自然界的節(jié)肢動物來說，其捕食作用受到各種環(huán)境因子的影響，每次的試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際情況下的捕食量、捕食后的消化速率以及捕食頻率都有一定差異?？梢?，節(jié)肢類捕食者捕食作用的定量評價是一件十分困難的事情。因此，柑橘木虱主要捕食性天敵對柑橘園其他昆蟲的捕食作用及生態(tài)關(guān)系還有待進(jìn)一步探索研究。

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