納米磁珠富集處理臨床標(biāo)本在分枝桿菌培養(yǎng)中的初步應(yīng)用

王相棟 邵吉寶 施旭東

結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)鑒定是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，目前在我國各級結(jié)核病診斷實驗室中，最常用的方法仍然是基于羅氏培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)法。而標(biāo)本的前處理是其關(guān)鍵步驟，常用的方式是NaOH去污染消化后直接接種或離心富集的方式。采用較好的標(biāo)本處理方法能夠提高陽性率、縮短檢出時間以及減少實驗室污染的發(fā)生[1]。納米磁珠作為一種磁流體，既具有液體的流動性，又易于吸附分離，在生物醫(yī)學(xué)上具有廣泛的運用。本研究采用納米磁珠富集的方式處理臨床標(biāo)本，并與直接接種法、離心法對比，以驗證其在分枝桿菌羅氏培養(yǎng)檢測中運用的可行性和優(yōu)缺點。

材料和方法

一、 標(biāo)本和試劑

1.標(biāo)本來源和選?。哼x取我院2012年12月至2013年3月間門診和病房送檢的結(jié)核病患者送檢標(biāo)本，在選擇痰液標(biāo)本時用目視檢查法[2]控制質(zhì)量，即干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、黏液痰，標(biāo)本量>2 ml。最終對103份臨床標(biāo)本(痰液93份，支氣管灌洗液7份，胸腔積液3份)進行實驗研究；其中男51例，平均年齡(49.20±18.71)歲；女52例，平均年齡(47.54±17.58)歲。標(biāo)本中有94份標(biāo)本來自于既往肺結(jié)核患者和研究期間最終被診斷為肺結(jié)核的患者，其余9份標(biāo)本為肺部其他細(xì)菌感染。

2.儀器和試劑：D8401型多功能電動攪拌器(天津華興偉業(yè)實驗儀器有限公司)、雷磁pHSJ-3F pH計(上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司)、超聲波細(xì)胞破碎儀XO-650(南京先歐儀器制造有限公司)、超級恒溫油槽YJ601(上海躍進醫(yī)療器械廠)、分析天平CP114(奧豪斯儀器上海有限公司)、磁力吸附分離試管架(自制)。0.22 μm的濾膜購自美國頗爾公司(Pall Corporation)。酸性羅氏培養(yǎng)基和中性羅氏培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。以下試劑均為分析純：FeCl2·4H2O購自上海強順化學(xué)試劑有限公司；PEG600和濃氨水購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；FeCl3·6H2O、NaOH、HCl、谷氨酸鈉、KH2PO4、K2HPO4、檸檬酸、H3PO4購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

二、方法

1.PEG600納米磁珠的制備：整個操作過程在通氮氣去氧的環(huán)境中進行。按摩爾比[溶液中所含物質(zhì)分子數(shù)(mol)的比值]1∶2將一定量FeCl2與FeCl3溶液加入100 ml去離子水中，機械攪拌(300 r/min)下加入PEG600(摩爾比為15)，持續(xù)攪拌20 min。隨后快速滴加氨水(濃氨水5倍稀釋)，并測量pH值達(dá)10.0以上，持續(xù)攪拌條件下反應(yīng)10 min；然后置80 ℃條件下(恒溫水槽中)持續(xù)攪拌，老化30 min。以強力磁鐵吸附分離，用去離子水洗滌，450 W超聲分散20 min，再用去離子水洗滌，共3次。用pH值為7.0的0.1 mol/L K2HPO4-檸檬酸緩沖液中和到中性。用0.22 μm的濾膜過濾。濕法保存[3]。

2.標(biāo)本的去污染和消化：參考文獻[2]和[4]作適當(dāng)調(diào)整。痰、灌洗液和胸腔積液標(biāo)本均各取2 ml加入含有碎玻璃的試管，加入2～4倍量的0.625 mol/L(2.5%)NaOH(終濃度為1.7%～2%)，2 min后充分振蕩，室溫放置30 min進行消化。

3.直接接種法培養(yǎng)：取0.1 ml處理后的樣品直接接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，每份標(biāo)本平行接種2管酸性羅氏培養(yǎng)基。置37 ℃溫箱中斜面向上平放1 d后，培養(yǎng)8周，每周觀察記錄結(jié)果。

4.離心法培養(yǎng)：取消化好的標(biāo)本2 ml，加入 0.23 mol/L 的H3PO43 ml，中和至pH 值6.5～7.5 之間，3000×g，離心 20 min?？焖賰A倒棄去上清，以殘留上清(約0.2 ml)沖洗試管底部，全部接種至2管中性羅氏培養(yǎng)基斜面上。置37 ℃溫箱中斜面向上平放1 d后，繼續(xù)培養(yǎng)8周，每周觀察記錄結(jié)果。

5.磁珠富集法培養(yǎng)：取消化好的標(biāo)本2 ml，加入0.23 mol/L的H3PO4溶液，中和至pH 值6.5～7.5之間；然后加入PEG600納米磁珠懸液0.2 ml，加塞混勻，37 ℃放置40 min。快速傾倒棄去上清，以殘留上清(0.2 ml)沖洗試管底部，全部接種至2管中性羅氏培養(yǎng)基斜面上。置37 ℃溫箱中斜面向上平放1 d后，培養(yǎng)8周，每周觀察記錄結(jié)果[3]。

6.結(jié)果判斷：(1)初生長時間的判定：以首次發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基斜面上有菌落生長的時間為標(biāo)準(zhǔn)。(2)污染率的判定：以標(biāo)本的份數(shù)為計算單位，同一份標(biāo)本的2個接種管均污染時認(rèn)為污染，若只有單只接種管污染則不認(rèn)為污染。污染率=污染份數(shù)/樣本數(shù)×100%[5]。

7.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗進行分析比較，以 Kolmogorov-Smirnov法檢測正態(tài)性，非正態(tài)分布的計量資料采用Wilcoxon秩和檢驗進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各種標(biāo)本處理方法的培養(yǎng)檢測敏感度及比較：94份肺結(jié)核患者標(biāo)本共有42份被檢出陽性，9份肺部其他細(xì)菌感染的標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果均為陰性(特異度100.00%)；檢測敏感度以陽性率表示。直接接種法檢出28份，陽性率為29.79%(28/94)，離心法和磁珠富集法陽性率分別為43.62%(41/94)、41.49%(39/94)；所有直接接種法陽性的標(biāo)本，離心法和磁珠富集法檢測均為陽性，具體見表1。

3種方法間比較分析，采用配對卡方檢驗。磁珠富集法、離心法陽性率均高于直接接種法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為9.09、11.08，P值均<0.01)；離心法與磁珠富集法間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.25，P=0.62)。直接接種法未檢出的14份樣本，磁珠富集法檢出11份，離心法檢出13份；11份生長的菌落數(shù)小于10個的標(biāo)本(離心法與磁珠富集法檢測)，直接接種法僅檢出2份。

2.污染率：直接接種法、離心法和磁珠富集法的污染率分別為：2.91%(3/103)、4.85%(5/103)、3.88%(4/103)。三者間采用配對卡方檢驗進行比較。直接接種法與離心法比較，χ2=0.50，P=0.48；磁珠富集法與離心法、直接接種法比較，χ2值均為0.00，P值均為1。三者間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.平均初生長時間：具體見表2。離心法和磁珠富集法的初生長時間數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布(Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗結(jié)果，P值均<0.01)；直接接種法與離心法、磁珠富集法有28份樣本共陽性，采用兩配對樣本的Wilcoxon秩和檢驗對28份共陽性標(biāo)本3種方法的初生長天數(shù)進行比較。直接接種法與磁珠富集法比較：Z=-3.983，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；直接接種法與離心法比較：Z=-3.980，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。離心法與磁珠富集法間有38份樣本共陽性，對初生長時間進行比較：Z=-0.557，P=0.577，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

討 論

1. 標(biāo)本去污染和消化步驟的改進：為了改善標(biāo)本的前處理步驟，提高結(jié)果的陽性率、縮短檢出周期、減少環(huán)境污染的發(fā)生。本研究采用磁珠富集法與實驗室常用的離心法、直接接種法進行比較，以驗證其可行性和優(yōu)缺點。筆者根據(jù)患者標(biāo)本的實際情況，在參考國家規(guī)范的基礎(chǔ)上對標(biāo)本去污染和消化步驟作了一定改變。我院臨床標(biāo)本中許多標(biāo)本來自既往肺結(jié)核患者，大多已經(jīng)經(jīng)過治療再復(fù)查，菌體已經(jīng)有所損傷。對比觀察中發(fā)現(xiàn)以1 mol/L(4%)NaOH濃度[2]相對偏高以致陽性率下降，而采用1996年的標(biāo)準(zhǔn)[4]污染率又相對偏高，因此采用0.625 mol/L(2.5%)的NaOH進行處理，能夠得到較高的陽性率、較低的污染率和較好的液化效果。同時參考Ratnam等[6]的報道，簡化了離心法的步驟, 加入 0.23 mol/L的H3PO4溶液3 ml可以使其與加入的NaOH形成pH值在7.0左右的緩沖體系，并且可以中和標(biāo)本pH值在6.5～7.5之間，如此避免了使用大體積PBS中和的步驟，節(jié)省了操作時間；由于加入的原始樣本量僅相當(dāng)于0.40～0.67 ml(2 ml去污染消化后的樣本為3～5倍稀釋的)，以殘留上清(約0.2 ml)完全可以將沉淀全部重懸。實驗中采用碎玻璃片取代玻璃珠是為了借助其切割力來更快的消化與均質(zhì)樣本。

表1 94份肺結(jié)核患者標(biāo)本3種處理方法培養(yǎng)結(jié)果對比(份)

注+：為培養(yǎng)陽性；-：為培養(yǎng)陰性

表2 標(biāo)本不同處理方法處理后的分枝桿菌初生長時間

注由于數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示[M(P25，P75)]

2.本研究3種方法間檢出陽性率的比較：94份肺結(jié)核患者標(biāo)本以磁珠富集法和離心法前處理的陽性率要高于直接接種法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而磁珠富集法和離心法間比較時差異無統(tǒng)計學(xué)意義。11份磁珠富集法和離心法檢測陽性而菌落生長數(shù)小于10個的樣本，直接接種法僅檢測出2份，可見經(jīng)過離心或者磁珠富集后，培養(yǎng)檢測的敏感度有很大的提高。國內(nèi)趙立平等[5]報道了離心法與直接涂片法差異不顯著， Liu等[7]報道了磁珠法、離心法用于涂片鏡檢的陽性率要高于直接涂片法，這可能與標(biāo)本的選取有關(guān)。在Liu等[7]的研究中不對標(biāo)本的性狀作判斷，惟一標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)本量>2.5 ml，這樣有利于觀察比較檢測方法的敏感度，而趙立平等[5]所選取標(biāo)本來自國家結(jié)核病臨床實驗室，直接涂片陽性率就高達(dá)50.0%(99/198)，可能標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌數(shù)量較多；這樣使得離心法與直接涂片法均能得到陽性結(jié)果，再以陽性率比較就不能很好體現(xiàn)離心法的富集作用。國外Wilson等[8]對比了離心法和磁珠富集法用于涂片鏡檢的結(jié)果，兩種方法陽性率相似；Mitarai等[9]在標(biāo)本經(jīng)過去污染和消化后，以TRICORE試劑吸附分離樣本中分枝桿菌后直接接種于固體和液體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)以液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時兩者陽性率相似，但在Ogawa固體培養(yǎng)基上磁珠富集法要優(yōu)于離心法。筆者根據(jù)相似相溶原則，以親脂性的PEG600包被磁珠，制備成納米顆粒以增加表面積，增強吸附能力。吸附后沉淀直接接種以減少洗脫過程可能會有的損失。研究中3種處理方法的污染率均未超過5%，三者間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明磁珠富集法與離心法并沒有在增加陽性率的同時，造成標(biāo)本污染概率的加大。

3.本研究3種方法間初生長時間的比較：對3種處理方法的初生長時間比較，發(fā)現(xiàn)直接接種法的平均初生長時間[M(P25，P75)]最長[28(21，40) d]，磁珠富集法與離心法培養(yǎng)所需的初生長時間均短于直接接種法，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，而磁珠富集法與離心法兩者間的初生長時間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明這2種方法均可縮短報告結(jié)果的時間。需要補充說明的是本次研究沒有對陽性菌株作進一步鑒定，其中可能包括了非結(jié)核分枝桿菌感染的情況，但對平均初生長時間的比較是在共陽性標(biāo)本間進行的，所以并不影響磁珠富集法、離心法可以縮短培養(yǎng)檢測周期的判斷。

本研究結(jié)果顯示，本室自制磁珠能夠較好地富集樣本中分枝桿菌并提高陽性率，與傳統(tǒng)離心的富集方式比較，有不需要離心設(shè)備、不受離心機通量影響的優(yōu)點；與免疫磁珠法比較[10]，成本十分低廉；制備方法簡單，其性能可以比擬類似的進口磁珠富集分枝桿菌試劑盒；由于操作過程幾乎全在生物安全柜內(nèi)進行，對環(huán)境的污染幾率也較小，也不存在離心過程會產(chǎn)生氣溶膠的問題。其陽性檢出率與離心法差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明磁珠富集法可以作為一種標(biāo)本的富集方法，具有一定的臨床實用性；并且其有可能在未來的全自動化封閉操作中發(fā)揮重要作用。

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