白花蛇舌草提取物體外抑制K562細胞增殖實驗研究

陳筱凡 杭州市中醫(yī)院檢驗科 杭州 310006

白花蛇舌草提取物體外抑制K562細胞增殖實驗研究

陳筱凡 杭州市中醫(yī)院檢驗科 杭州 310006

目的：觀察白花蛇舌草提取物（HDE）體外對人白血病細胞株K562增殖的影響，探討HDE用于治療白血病的作用機制。方法：以白血病K562細胞株為靶細胞，觀察不同濃度的HDE對K562細胞增殖的影響，及胞內(nèi)線粒體跨膜電位（ΔΨm）的水平；檢測低濃度HDE處理前后胞內(nèi)Survivin、Bcl-2基因表達。結(jié)果：HDE（6.4mL/L）能明顯抑制K562細胞增殖，且與濃度呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。通過流式細胞術(shù)對碳氰化合物類親脂性熒光染料（JC-1）檢測發(fā)現(xiàn)，HDE能使靶細胞內(nèi)ΔΨm降低，且與HDE處理濃度呈負相關(guān)；K562細胞經(jīng)低濃度HDE（3.2mL/L）處理3周后，Survivin、Bcl-2基因表達均低于未經(jīng)處理細胞的2.7倍和1.6倍。結(jié)論：HDE可能通過降低線粒體跨膜電位，抑制抗凋亡基因的表達，抑制K562白血病細胞增殖。

白花蛇舌草提取物 K562細胞 跨膜電位 凋亡基因

白花蛇舌草是我國民間治癌的有效中草藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫止痛等功效，臨床上用于濕熱蘊毒所致上呼吸道感染、闌尾炎、肺炎、扁桃體炎及術(shù)后感染[1]。近年研究顯示白花蛇舌草提取物（HDE）對白血病也有較好的療效[2-3]。筆者以K562細胞作為靶細胞，觀察HDE對白血病細胞線粒體跨膜電位等的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 白花蛇舌草提取物購于通化振國藥業(yè)有限公司，批號091015。處理細胞時，用RP?MI1640（Gibco）配置成所需濃度的工作液（終濃度分別為：1.6mL/L、3.2mL/L、6.4mL/L、12.8mL/L和25.6mL/ L）。K562細胞株購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。用含10%小牛血清的RP?MI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，然后取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2 方 法

1.2.1 HDE對K562細胞增殖抑制試驗 用含10%小牛血清、1×105細胞/mL和不同濃度的HDE的培養(yǎng)體系共200μL，置于96孔板中，每個濃度作4個平行孔，以不加HDE作對照組。培養(yǎng)72h，在終止培養(yǎng)前4h加MTT（5g/L）20μL/孔，離心，每孔加150μL DMSO，振蕩，酶標儀570nm處測吸光度（A570）。

1.2.2 線粒體跨膜電位（ΔΨm）水平檢測 不同濃度的HDE分別處理K562細胞24、48、72h后，PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度（1×106/mL），加入碳氰化合物類親脂性熒光染料（JC-1）5μL（1mg/mL），混勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，避光孵育30min，再PBS洗滌2次后進行流式細胞儀檢測，熒光通道FL1（520nm，綠色）和FL2（590nm，紅色）與熒光強度，計算FL1與FL2的比值，表示線粒體跨膜電位水平變化。

1.2.3 HDE處理前后Survivin、Bcl-2基因表達 ①總RNA提?。菏占銐虻募毎凑誘rizol一步法操作。分裝-80℃保存，備用。②半定量RT-PCR兩基因擴增：cDNA合成：20μL逆轉(zhuǎn)錄體系含有5×Bfr、Oligo dT、dNTP、RNasin、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR擴增：體系包括10×PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、10mM dNTP、Survivin或Bcl-2引物、β-actin、Taqase、RT產(chǎn)物、DEPC水。94℃變性55Sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，33個循環(huán)；最后72℃延伸10min。③產(chǎn)物電泳：取產(chǎn)物10μL，瓊脂糖凝膠（1.2%），電泳3h，進行觀察、拍照并用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，保存。實驗重復(fù)3次。見表1。

表1 PCR擴增各引物序列

2 結(jié) 果

2.1 HDE抑制K562細胞增殖作用 MTT結(jié)果顯示，1.6mL/L、3.2mL/L濃度的HDE對K562細胞幾乎無抑制作用，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中濃度以上HDE（6.4mL/L）可抑制K562細胞增殖，并與濃度相關(guān)，見表2。

2.2 HDE處理前后線粒體跨膜電位（ΔΨm）水平變化 HDE處理24h后，細胞線粒體跨膜電位有所下降。48h后細胞內(nèi)線粒體跨膜電位下降的百分率顯著增加，F(xiàn)L1/FL2比值明顯增大。細胞繼續(xù)培養(yǎng)至72h后，胞內(nèi)線粒體跨膜電位下降無明顯變化，見圖1～2。

2.3 HDE處理前后Survivin、Bcl-2抗凋亡基因表達結(jié)果 半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示HDE（3.2mL/ L）處理2周前后，Survivin、Bcl-2表達變化不明顯；處理至3周左右時，Survivin、Bcl-2表達都明顯低于未經(jīng)處理過細胞的2.7倍和1.6倍，見圖3。

表2 不同濃度HDE對K562細胞增殖抑制作用（±s）

表2 不同濃度HDE對K562細胞增殖抑制作用（±s）

注：與HDE 0mL/L比較，*P＜0.05，**P＜0.01

HDE/（mL/L）0 1.6 3.2 6.4 12.8 25.6 n/孔444444吸光度0.94±0.05 0.90±0.06 0.88±0.07 0.75±0.06* 0.62±0.05** 0.35±0.04*

圖1 不同濃度HDE作用對K562細胞跨膜電位的影響

3 討 論

研究表明，各種死亡信號誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變孔（PTP）開放，引起線粒體跨膜電位下降，使膜通透性增高，導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)釋放，繼而激活Caspase一系列酶，最終引起細胞凋亡[4]。線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△Ψm）是反映線粒體內(nèi)膜通透性的最佳指標之一。它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，如果線粒體跨膜電位崩潰，那么細胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。當(dāng)PTP開放時，＜1.5KD的分子通過，導(dǎo)致內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失，△Ψm崩潰，呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯(lián)，ATP合成停止，Ca2+外流，還原性谷胱甘肽和NAD（P）H2減少，超氧陰離子增加，凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）釋放等，最終引起細胞凋亡或死亡[5]。研究證實細胞凋亡的早期階段，在細胞核病理改變出現(xiàn)前，ΔΨm已經(jīng)下降，提示ΔΨm下降為凋亡的早期階段[6]。JC-1在正常細胞線粒體膜電位較高時，能聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，在激光共聚焦顯微鏡下可見桔黃色熒光；在凋亡早期細胞中因線粒體膜電位下降，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,以單體在胞漿內(nèi)積聚，在激光共聚焦顯微鏡下可見綠色熒光。

圖2 不同濃度HDE處理K562細胞48h后流式細胞術(shù)檢測結(jié)果（A：1.6mL/L、B：3.2mL/L、C：6.4mL/L、D：12.8mL/L、E：25.6mL/L）

圖3 HDE處理K562細胞后Survivin和Bcl-2mRNA表達

Bcl-2家族蛋白可以調(diào)節(jié)PTP通道的開放及其細胞色素C、AIF的釋放，還可以改變線粒體外膜的通透性。癌基因產(chǎn)物絲-蘇氨酸激酶(c-Raf)蛋白與位于線粒體外膜的Bcl-2蛋白及構(gòu)成PTP通道的核心電壓依賴性陰離子孔道（VDAC）結(jié)合形成復(fù)合體，抑制VDAC誘導(dǎo)的線粒體膜去極化，干預(yù)功能性PTP通道的形成，阻斷細胞色素 C自線粒體釋放，抑制細胞凋亡[7]，而位于線粒體外膜的促凋亡因子Bax的轉(zhuǎn)位，可導(dǎo)致△Ψm降低，細胞色素 C釋放入胞質(zhì)，促進細胞凋亡。因此影響B(tài)cl-2家族（特別是Bcl-2、Bax）表達的因素，均能引起細胞的凋亡或死亡。

本研究結(jié)果顯示，HDE能抑制K562白血病細胞惡性克隆增殖，HDE處理24h后就能引起K562細胞線粒體跨膜電位的下降，48h后線粒體跨膜電位下降最明顯，其后下降無明顯變化。低濃度HDE培養(yǎng)3周后能明顯抑制Survivin、Bcl-2抗凋亡基因表達，故推測HDE能抑制白血病細胞增殖，其機制可能使線粒體跨膜電位下降，導(dǎo)致通透性增加，促凋亡蛋白被釋放到細胞質(zhì)中，這些促凋亡蛋白或激活caspase、或獨立地破壞核內(nèi)染色質(zhì),從而引起細胞凋亡。

［1］Zhong LM，Zhou HX，Liu D.Recent development of studies on clinical application and phamacological functions of old?enlandia difusa wild［J］.Inf Tradit Chin Med（中醫(yī)藥信息），2001，l8（4）：14.

［2］黃景玉，王祥麒，高萍.白花蛇舌草針聯(lián)合化療治療急性非淋巴細胞白血病臨床觀察［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2001，16（4）：38.

［3］Jiangsu New Medical College.Herbal macro-dictionary（中藥大辭典）［M］.Shanghai：Shanghai People Publishing Company，1997：754.

［4］蔡循，陳國強，陳竺，等.線粒體跨膜電位與細胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2001，28（1）：3.

［5］Fall CP，Bennett JP.Visualization of cyclosporin A and Ca2+ sensitive cyclical mitochondrial depolarizations in cell culture［J］.Biochim Biophy Acta，1999，1410（1）:77.

［6］Zamzami N，Marchetti P，Castedo M，etal.Reduction in mitochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte death in vivo［J］.J Exp Med，1995， 181（5）:1661.

［7］Le Mellay V，Troppman J，Benz R，et al.Negative regulation of mitochondrial VDAC channels by C-Raf kinase［J］.BMC Cell Biol，2002，3（1）:14.

Hedyotis Herb Extracts Inhibited the Proliferation of Human Leukemia Cell Line K562 in vitro

CHEN Xiaofan. Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou(310006)，China

Objective:To determine the effect of hedyotis herb extracts(HDE)on the proliferation of human leukemia cell line K562 in vitro.Methods:Human leukemia cell line K562 was used and was treated by varied concentrations of HDE(1.6,3.2,6.4,12.8,25.6ml/L).Variation of mitochondrial transmembrane potential was measured be?fore and after treatment.Survivin and Bcl-2 in K562 cells were detected before and after treatment of 3.2ml/L HDE for 3 weeks.Results:HDE at the dose of 6.4m l/L inhibited the proliferation of K562 cells and the effect was enhanced as the dose increased.HDE decreased mitochondrial transmembrane potential in K562 cells and the decrease was negatively related to the concentration of HDE.The expression of survivin and Bcl-2 on K562 cells before the treatment of 3.2m l/L HDE was 2.7 and 1.6 times higher than those after treatment.Conclusion: HDE can inhibit the proliferation of K562 cells by decreasing mitochondrial transmembrane potential and sup?pressing anti-apoptosis genes.

hedyotis herb extracts K562 cells transmembrane potential apoptosis genes

2012-08-31