芹菜素對人肺癌A549細胞凋亡及相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達的影響

潘雪刁，楊周萍，周四桂，楊志英，臧林泉，王桂香

芹菜素對人肺癌A549細胞凋亡及相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達的影響

潘雪刁，楊周萍，周四桂，楊志英，臧林泉，王桂香

目的 研究芹菜素對人肺癌 A549 細胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用與 Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響。

芹菜素； 肺腫瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡； bcl-2 相關(guān) X 蛋白； 原癌基因蛋白質(zhì) c-bcl-2

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(4):259-263

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一[1]，也是我國第一大癌癥，其發(fā)病率及死亡率增長最為迅速[2]。目前肺癌的主要治療手段是化療，但化療的毒副作用如骨髓抑制等卻限制了其應(yīng)用。研發(fā)新型活性高、毒副作用小的抗肺癌藥物一直是腫瘤治療領(lǐng)域的重要任務(wù)，近年來中藥抗肺癌研究也取得了很大進展。

芹菜素（apiginin，API），又稱芹黃素，是一種天然存在的黃酮類化合物，廣泛分布于溫?zé)釒У氖卟撕退校纫郧鄄酥泻繛楦?，具有廣泛的藥理作用[3]，其對腫瘤的防治作用及其機制得到廣泛的關(guān)注和研究[4-11]，但有關(guān)芹菜素抗肺癌作用的實驗研究尚少。本實驗觀察了芹菜素對人肺癌細胞株A549 的增殖抑制以及誘導(dǎo)凋亡作用，初步探討其促進凋亡的機制，為肺癌的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、試劑 芹菜素（質(zhì)量分數(shù) ≥ 98 %，批號：22806）購自上海阿拉丁公司；MTT、Hoechst 33258、DMSO、亮肽酶、抑肽酶、疊氮鈉、二硫蘇糖醇購自美國 Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購自美國 Gibco 公司；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人抗兔 Bax、Bcl-2 及GAPDH 抗體購自美國 Abcam 公司；羊抗兔二抗購自美國 CST 公司；PVDF 膜購自美國 Millipore公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗儀器 EPICS XL 分析型流式細胞儀為美國 Beckman 公司產(chǎn)品；Zeiss Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡為德國 Carl Zeiss 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞株 A549購自中國科學(xué)院上海細胞庫；培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，于 37 ℃、5% CO2、95% O2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖抑制率 將 A549細胞以 1 × 104個/孔接種于 96 孔板中，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為 0、10、20、40、80 μmol/L芹菜素，每孔 200 μl，每個濃度設(shè)置 6 個平行孔，培養(yǎng) 24、48、72 h 后，向每孔中加入 5 g/L 的MTT 20 μl 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，向每孔中加入DMSO 100 μl 溶解結(jié)晶體，置于搖床振蕩 10 min，至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀 570 nm 波長處測定每孔吸光度值（A），并計算細胞增殖抑制率（%）=（對照孔 A 值 - 加藥孔 A 值）/對照孔 A 值 × 100%。實驗重復(fù) 3 次。

1.2.3 Hoechst 33258 細胞核染色法觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變 細胞處理同“1.2.2”項方法，芹菜素作用 24 h 后，吸去培養(yǎng)液，用 PBS 清洗2 次，迅即加入 40 g/L 的多聚甲醛液固定 10 min后，吸去固定液，以 PBS 清洗 1 次，加入 5 mg/L的 Hoechst 33258，染色 10 min，用 PBS 清洗3 次后，自然干燥，在 Zeiss Axio Observer A1 熒光倒置顯微鏡下以 340 nm 激發(fā)光觀察細胞凋亡形態(tài)并隨機拍照。實驗重復(fù) 3 次。

1.2.4 流式細胞儀 AnnexinV-FITC/PI 雙染色法檢測細胞凋亡率 將 A549 細胞以 1 × 105個/孔接種于 6 孔板中，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為 0、10、20、40、80 μmol/L 芹菜素，每孔 1 ml，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，按照 AnnexinV- FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，采用流式細胞儀進樣測定，根據(jù) Annexin V-FITC(X)/PI（Y 軸）熒光做對數(shù)散點圖，可獲得由 4 個象限組成的雙參數(shù)圖：左上象限（K1）為細胞收集過程中產(chǎn)生的損傷細胞，右上象限（K2）為晚期凋亡細胞和壞死細胞，左下象限（K3）為活細胞，右下象限（K4）為早期凋亡細胞，每個象限的細胞數(shù)即為受檢總細胞數(shù)中所占的比例。實驗重復(fù) 3 次。

1.2.5 Western blot 法檢測 Bax、Bcl-2 蛋白表達 細胞處理同“1.2.4”項方法，芹菜素作用 24 h后，收集細胞，在每管細胞中加入 100 μl 的蛋白裂解液后，取 20 μl 的細胞裂解液加入 5 μl 上樣緩沖液中，沸水浴 5 min，12 000 × g 離心 3 min，去除不溶性蛋白，考馬斯亮藍 G-250 法進行總蛋白定量，每泳道上樣量為 25 μg 總蛋白，經(jīng) 10% SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。用含 5%脫脂牛奶的 TBST 室溫下封閉 90 min，加入稀釋好的一抗 Bax（1∶5000）、Bcl-2（1∶1000），4 ℃ 孵育過夜。TBST 洗膜后，加 5 ml 1∶5000 稀釋的羊抗兔二抗，室溫孵育 1 h 后，TBST 洗膜，然后加入 ECL 化學(xué)發(fā)光液，X 光片暗室曝光、顯影及定影。采用 WO-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro 32 分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參照（GAPDH）灰度面積的乘積反映相對蛋白表達豐度。實驗重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以表示，組間差異顯著性比較采用t 檢驗，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同濃度芹菜素于不同作用時間對 A549 細胞增殖的抑制率（%，，n = 3）Table1 Inhibition of A549 cells after different time points of incubation with API at various concentrations (%,, n = 3)

表1 不同濃度芹菜素于不同作用時間對 A549 細胞增殖的抑制率（%，，n = 3）Table1 Inhibition of A549 cells after different time points of incubation with API at various concentrations (%,, n = 3)

注：與空白對照組比較，**P < 0.01。Note:**P < 0.01 vs. control group.

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圖1 Hoechst 33258 染色觀察細胞核的形態(tài)學(xué)變化（× 100）Figure1 Morphological changes of the nucleus of A549 cells were observed by Hoechst 33258 staining (× 100)

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對 A549 細胞增殖的抑制作用

結(jié)果見表 1，以芹菜素不同濃度（10、20、40、80 μmol/L）和不同時間（24、48、72 h）處理 A549細胞后，細胞增殖受到明顯的抑制，與空白對照組相比具有顯著性差異（P < 0.01），當(dāng)同一芹菜素濃度作用時間逐漸延長或同一作用時間芹菜素濃度逐漸升高時，對 A549 細胞的增殖抑制作用逐漸增強，呈濃度和時間依賴性。

2.2 芹菜素誘導(dǎo) A549 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

以 10 ～ 80 μmol/L 芹菜素處理 A549 細胞24 h 后，在熒光顯微鏡下觀察，可見部分細胞皺縮，出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等典型的細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變（如箭頭所示），見圖 1B ～ E。而空白對照組以活細胞為主，核呈圓形或橢圓形，為藍色均勻淡染，細胞核膜完整，未見凋亡細胞，見圖 1A。

表2 不同濃度芹菜素作用 24 h 對 A549 細胞凋亡率的影響（%，，n = 3）Table2 Apoptotic rate of A549 cells induced by API at various concentrations after 24 h (%,s, n = 3)

表2 不同濃度芹菜素作用 24 h 對 A549 細胞凋亡率的影響（%，，n = 3）Table2 Apoptotic rate of A549 cells induced by API at various concentrations after 24 h (%,s, n = 3)

注：與空白對照組比較，P < 0.01。Note:**P < 0.01 vs. control group.

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圖2 不同濃度芹菜素對 A549 細胞凋亡率的影響Figure2 Apoptotic rate of A549 cells induced by incubation with API

2.3 芹菜素對 A549 細胞的凋亡誘導(dǎo)作用

芹菜素對 A549 細胞的凋亡誘導(dǎo)作用結(jié)果見表 2、圖 2，10 ～ 80 μmol/L 芹菜素處理 24 h 后，細胞凋亡率隨著芹菜素濃度的升高逐漸增加，與空白對照組相比具有顯著性差異（P < 0.01）。提示芹菜素對 A549 細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)具有濃度依賴性。

2.4 芹菜素誘導(dǎo) A549 細胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平的改變

結(jié)果見圖 3，10 ～ 80 μmol/L 芹菜素處理 24 h后，促凋亡蛋白 Bax 隨著芹菜素濃度升高表達逐漸增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 隨著芹菜素濃度升高表達逐漸減少。對條帶的灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析，隨芹菜素濃度升高，Bax/Bcl-2 比值逐漸增大，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05，P < 0.01），見圖 4。此結(jié)果提示芹菜素可能通過上調(diào) Bax 和下調(diào) Bcl-2 蛋白表達誘導(dǎo) A549 細胞凋亡。

圖3 芹菜素對 A549 細胞 Bax 和 Bcl-2 表達的影響Figure3 Expression of Bax and Bcl-2 in A549 cells after API treatment

圖4 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達比值（與空白對照組相比，*P < 0.05；**P < 0.01）Figure4 Ratio of the expression of Bax and Bcl-2 (*P < 0.05;**P < 0.01 vs. control)

3 討論

細胞的增殖、分化和凋亡，維持著正常組織的生長平衡。如果打破這種平衡，凋亡受抑，細胞死亡率降低，機體不能重新恢復(fù)調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出生長優(yōu)勢最終形成腫瘤。細胞凋亡受到抑制有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而促進腫瘤細胞的凋亡則可以促使腫瘤的消退。

芹菜素作為一種植物提取的活性成分，具有資源豐富，毒性低的優(yōu)點，大量研究表明，芹菜素對多種腫瘤細胞均有抑制作用，但有關(guān)芹菜素抗肺癌作用研究鮮有報道。本實驗首先使用不同濃度芹菜素作用 A549 細胞不同時間，MTT 法檢測細胞增殖抑制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芹菜素呈濃度和時間依賴性地抑制 A549 細胞增殖。通過 Hoechst 33258 細胞核染色和流式細胞儀檢測結(jié)果進一步證實了芹菜素可呈濃度依賴性地誘導(dǎo)人肺癌 A549 細胞凋亡。

芹菜素對癌細胞促凋亡作用是通過多種途徑實現(xiàn)的，其中包括參與癌細胞凋亡基因調(diào)控，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達，阻滯細胞周期，干擾信號傳導(dǎo)等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可呈濃度依賴性地下調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達，同時上調(diào)促凋亡蛋白 Bax 表達，我們推測芹菜素誘導(dǎo) A549 凋亡的機制可能與上調(diào) Bax 和下調(diào) Bcl-2 的表達，導(dǎo)致 Bax/Bcl-2比值增加。但由于細胞凋亡的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，對芹菜素抗肺癌機制仍需更進一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素作為一種天然存在的黃酮類化合物，能夠抑制人肺癌 A549 細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，可為芹菜素應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

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Effect of apigenin on apoptosis an d expression of Bax and Bcl-2 in A549 human lung cancer cells

PAN Xue-diao, YANG Zhou-ping, ZHOU Si-gui, YANG Zhi-ying, ZANG Lin-quan, WANG Gui-xiang

Objective To investigate the effect of apigenin on proliferation, and apoptosis, as well as Bax and Bcl-2 protein expression in human lung cancer cell line A549.Methods A549 cells cultured in vitro were treated with 10 ～ 80 μmol/L different concentration of apigenin. MTT was used to detect the inhibitory rates according to the formula. Apoptosis of A549 cells was observed in a fluorescence microscope by Hoechst 33258 staining and quantified by flow cytometry using annexin V-FITC/PI staining. The expressions of apoptosis-related protein Bax and Bcl-2 were analyzed by Western blot.Results The inhibition of proliferation by apigenin was concentration-dependent and time-dependent. A549 cells treated with apigenin showed significant morphological changes in different apoptotic phases. The apoptotic rate was concentration-dependently increased. Western blot analysis indicated that apigenin increased the protein level of Bax, and reduced the protein level of Bcl-2.Conclusion Apigenin can inhibit proliferation and induce apoptosis of human lung cancer cell line A549, which might be related with up-regulated expression of Bax and down-regulated expression of Bcl-2.

Apigenin; Lung neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; bcl-2-associated X protein; Proto-oncogene proteins c-bcl-2

WANG Gui-xiang, Email: wgx306@yahoo.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.004

國家自然科學(xué)基金（81102465）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2011zx09102-001-31）；廣東省科技計劃項目（2010B031 500034）；廣州市科技計劃項目（2010J-E091）

510006 廣州，廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院藥理系新藥篩選與藥效學(xué)評價中心（潘雪刁、楊周萍、周四桂、臧林泉、王桂香）；518035 深圳市第二人民醫(yī)院營養(yǎng)科（楊志英）

王桂香，Email：wgx306@yahoo.com.cn

2013-06-25

方法 10 ～ 80 μmol/L 不同濃度芹菜素作用 A549 細胞，采用 MTT 法檢測芹菜素對 A549 細胞增殖抑制作用；Hoechst 33258 細胞核染色法觀察芹菜素誘導(dǎo)細胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化；流式細胞儀 AnnexinV- FITC/PI 雙染色法檢測細胞凋亡率；Western blot 法檢測凋亡相關(guān)蛋白 Bax 和 Bcl-2表達的變化。

結(jié)果 MTT 法顯示，芹菜素對 A549 細胞有顯著的增殖抑制作用（P < 0.01），且具濃度和時間依賴性；熒光顯微鏡下觀察到芹菜素處理組細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細胞核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等；流式細胞儀分析結(jié)果顯示，芹菜素呈濃度依賴性誘導(dǎo) A549 細胞凋亡；Western blot結(jié)果顯示，促凋亡蛋白 Bax 隨著芹菜素濃度升高表達增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 隨著芹菜素濃度升高表達減少。

結(jié)論 芹菜素具有抑制人肺癌 A549 細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡的作用，其機制可能與上調(diào) Bax 蛋白表達和下調(diào) Bcl-2蛋白表達有關(guān)。

Author Affiliations: New Drug Screening and Pharmacodynamics Evaluation Center, Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China (PAN Xue-diao, YANG Zhou-ping, ZHOU Si-gui, ZANG Lin-quan, WANG Gui-xiang); Nutritional Department, The Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518035, China (YANG Zhi-ying)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):259-263