酒曲生物轉(zhuǎn)化降解河豚毒素的初步研究

賈晉斌，舒靜，彭銳，孫惠川，王文權(quán)，崔安雷

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種氨基全羥基喹唑啉化合物，通常以“兩性離子”的形式存在[1]，是豚毒魚類及其他生物體內(nèi)含有的一種生物堿，也是一種劇毒的非蛋白質(zhì)天然神經(jīng)毒素。TTX為毒性極強(qiáng)的生物毒素之一，其毒性比氰化鉀強(qiáng)1250 倍，且無有效的解毒劑[2]。河豚毒素中毒后，潛伏期短、病死率高，吸收后迅速作用于末梢神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使神經(jīng)傳導(dǎo)障礙，首先感覺神經(jīng)麻痹，后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)麻痹，嚴(yán)重的腦干麻痹導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭[3]。

目前國內(nèi)外對(duì)河豚毒素的微生物來源、性質(zhì)以及河豚魚源的河豚毒素提取和檢測方面研究頗多，但微生物能否降解河豚毒素尚未見報(bào)道。在日本石川縣，用河豚卵巢做的米糠浸漬醬菜，是將河豚的卵巢用鹽腌藏以后，再放入米糠中讓其發(fā)酵，經(jīng)過鹽漬一段時(shí)間后，河豚魚的卵巢毒性可以降低到一個(gè)可供食用的水平[4]。這可能是米糠中的某些微生物作用的結(jié)果。而在白酒釀造過程中，酒曲是用高粱、玉米、大米、大麥、糯米、米粉或麩皮等糧食作物作為原料，加入一定量的母曲，在控制溫度和濕度的條件下制成的，其中的微生物主要有霉菌、酵母還有少量的細(xì)菌。本研究擬在已建立的離子色譜法定量檢測酒曲發(fā)酵液中的河豚毒素[5]的基礎(chǔ)上，以酒曲為基質(zhì)，利用酒曲發(fā)酵液中微生物種群這一生態(tài)體系達(dá)到轉(zhuǎn)化降解河豚毒素的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基 黑曲霉（Aspergillus niger BYK0001008）、青霉（Penicillium BYK0001005）、黑根霉（Rhizopus nigricans BYK0001003）、釀酒酵母（S.cerevisiae BYK00049-01-01）、乳酸菌（Lactobacillus BYK00056-01-01）取自農(nóng)業(yè)部漁業(yè)動(dòng)植物病原庫。PDA 培養(yǎng)基和 MRS 培養(yǎng)基，用0.1 MPa 壓力滅菌 20 min。

1.1.2 儀器、試劑及材料 GSP-9270MBE 隔水式恒溫培養(yǎng)箱為上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；GHP-9050 隔水式恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；DL-5-B 型低速離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用水為 Millipore Advantage A10 超純水；濃硫酸、磷酸為分析純，購自國藥集團(tuán)；TTX 標(biāo)準(zhǔn)品（純度 ≥ 99%）購自河北省水產(chǎn)研究所；酒曲為山東黃河龍酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)昆明小鼠，雄性，30 ～32 g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心。

1.2 方法

1.2.1 TTX 溶液的配制 1 mg TTX 標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 ml 0.1% 的磷酸溶液中，制成 100 mg/L 的溶液，依次稀釋成 40、60、80、100 mg/L 的 TTX溶液。

1.2.2 配制指示菌懸液 將三種霉菌（黑曲霉、青霉、根霉）制成一定濃度的稀釋液：將 121 ℃ 滅菌 20 min 的無菌水加入到培養(yǎng)有霉菌斜面的試管中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，將含有孢子的無菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入玻璃珠，在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后得到單孢子懸液 10 ml。釀酒酵母和乳酸菌[6]分別在 PDA 液體培養(yǎng)基和 MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3 d 后，分別用無菌吸管從三角瓶中吸取1 ml 孢子液注入盛有 9 ml 無菌水的試管中，以此類推，制成 10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度的菌懸液。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)方法[7]將 PDA 固體培養(yǎng)基和MRS 固體培養(yǎng)基在高壓滅菌釜中，用 0.1 MPa 壓力滅菌 20 min，并冷卻至 60 ℃ 左右，用吸管準(zhǔn)確量取 20 ml，加入內(nèi)徑一致并預(yù)先水平放置的培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后干燥培養(yǎng)皿中水份，吸取一定濃度的指示菌懸液 0.3 ml 至平板上，用無菌玻耙涂布均勻，涂布后以平板無可見水滴為準(zhǔn)，并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中均勻地放置 4 只牛津杯。吸取一定濃度的TTX 溶液 0.25 ml 至上述牛津杯中，注意不要將TTX 溶液溢出牛津杯外。將陶瓦蓋蓋在加入 TTX溶液的平皿上，然后將其放置在 35 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d 后拍照。

1.2.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化速率的影響 稱取 30 g酒曲于三角瓶中，添加 1 ml 上述配制好的 100 mg/L TTX 溶液，攪拌均勻，分別稱重，記錄。置于30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 48 h 依次取樣一次，稱重，及時(shí)添加去離子水以補(bǔ)充在培養(yǎng)過程中蒸發(fā)的水分。在培養(yǎng)過程中，每天早晚都予以攪拌。取好的樣品置于 –18 ℃ 冰箱中保存。

1.2.4.2 酒曲投加量對(duì)轉(zhuǎn)化速率的影響 分別往10、20、30、40、50、60 g 酒曲中添加 1 ml 100 mg/L的 TTX 溶液，攪拌均勻，置于 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，48 h 后取樣測發(fā)酵液中 TTX 的濃度。TTX 的轉(zhuǎn)化速率 =（TTX 的初始濃度 － 轉(zhuǎn)化后 TTX 的濃度）/時(shí)間。

1.2.4.3 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化速率的影響 將酒曲發(fā)酵液中加入 1 ml 100 mg/L 的 TTX 溶液，攪拌均勻，分別置于 20、25、30、35、40 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，48 h 后取樣測發(fā)酵液中 TTX 的濃度。

1.2.4.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化速率的影響 將酒曲發(fā)酵液中加入 1 ml 100 mg/L 的 TTX 溶液，攪拌均勻，靜置，30、50、100、150 r/min 搖床培養(yǎng)箱中30 ℃ 恒溫培養(yǎng)，48 h 后取樣測發(fā)酵液中 TTX 的濃度。

1.2.5 小鼠法檢測轉(zhuǎn)化效果 在上述確定的最佳轉(zhuǎn)化條件下，用小鼠法[8-9]檢測酒曲發(fā)酵液對(duì) TTX的轉(zhuǎn)化效果。以注射器中樣液全部注入小鼠體內(nèi)開始計(jì)時(shí)，以出現(xiàn)河豚毒素中毒的典型癥狀為標(biāo)準(zhǔn)判斷小鼠是否為中毒致死，以小鼠停止呼吸為判斷時(shí)間終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。小鼠中毒的典型癥狀是注射后先安靜，隨后急動(dòng)、轉(zhuǎn)圈、動(dòng)作生硬不靈活、大口呼吸、抽搐，最終死亡。

1.2.5.1 樣品處理 稱取 40 g 酒曲于三角瓶中，分別添加 1 ml 100 mg/L 和 10 mg/L 的 TTX 溶液，攪拌均勻，置于 30 ℃，轉(zhuǎn)速為 50 r/min 的培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)，每隔 48 h 取樣一次，分別標(biāo)號(hào)。樣品中加 0.1% 磷酸乙腈溶液，5000 r/min 離心10 min，取上清液，50 ℃ 減壓蒸餾除去乙腈，用0.1% 的磷酸溶液溶解定容至 1 ml。

1.2.5.2 小鼠法檢測條件 把 TTX 標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸溶解為 1 mg/L，不斷稀釋，取 0.3 ml 腹腔注射小鼠，至小鼠死亡時(shí)間接近 30 min，當(dāng)稀釋至濃度為 0.1 mg/L 的 TTX 標(biāo)準(zhǔn)品溶液注射小鼠時(shí)，小鼠未死亡。樣品中的 TTX 提取出來后，取 0.3 ml注射小鼠，每個(gè)樣重復(fù) 3 次，取平均死亡時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)確定 TTX 初始濃度

從圖 1 中可以看出，對(duì)于各種稀釋度的指示菌懸液，在 4 種濃度的 TTX 溶液作用下，均無明顯抑菌圈出現(xiàn)，說明 100 mg/L 以內(nèi)的 TTX 濃度對(duì)酒曲中的微生物沒有影響。

2.2 條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間的影響 利用離子檢測方法對(duì)每隔 48 h 取樣酒曲樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過一段時(shí)間，河豚毒素的含量發(fā)生了很大變化，圖 2 為添加到酒曲發(fā)酵液中的 TTX 含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化的趨勢圖。

由圖 2 可見，隨著時(shí)間的增加，酒曲的毒素轉(zhuǎn)化率也隨之增加，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為 6 d 時(shí)，酒曲的毒素轉(zhuǎn)化率最高，毒素轉(zhuǎn)化率達(dá)到 80% 以上，隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)增加，酒曲中開始出現(xiàn)雜菌生長，且有不良?xì)馕渡⒊觯灰嗽倮^續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度的 TTX 溶液對(duì)幾種微生物的抑菌效果Figure1 Antibacterial activity of different concentrations of TTX solution to several microorganisms

圖2 酒曲中 TTX 含量隨時(shí)間變化趨勢Figure2 Trends over time of TTX content in distiller's yeast

2.2.2 酒曲投加量的影響 由圖 3 可以看出，隨著酒曲投加量的增加，TTX 的轉(zhuǎn)化速率也隨之增加，直到投加量為 40 g 時(shí) TTX 的轉(zhuǎn)化速率最高，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 76.8%，當(dāng)投加量超過 40 g 時(shí)，酒曲對(duì) TTX 的轉(zhuǎn)化速率基本維持不變。

2.2.3 培養(yǎng)溫度的影響 不同溫度下，培養(yǎng) 2 d后酒曲在 30～35 ℃ 對(duì) TTX 的降解效果最為顯著，達(dá)到 90% 以上（圖 4）。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速的影響 在實(shí)驗(yàn)中，由于酒曲是半固體狀態(tài)，采用搖床振蕩培養(yǎng)來考察通氣量對(duì)TTX 轉(zhuǎn)化速率的影響。結(jié)果（圖 5）表明，一定的通氣量對(duì) TTX 的轉(zhuǎn)化有一定促進(jìn)作用。靜置培養(yǎng)或搖床轉(zhuǎn)速過大均不利于酒曲對(duì) TTX 的轉(zhuǎn)化。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá) 50 r/min 時(shí)可獲得最佳的轉(zhuǎn)化效果。

圖3 不同酒曲投加量對(duì) TTX 轉(zhuǎn)化速率的影響Figure3 Influence of different distiller's yeast dosage to TTX transformation rate

圖4 不同溫度下對(duì) TTX 轉(zhuǎn)化速率的影響Figure4 Influence of different temperature to TTX transformation rate

圖5 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì) TTX 轉(zhuǎn)化速率的影響Figure5 Influence of different shaker rotate speed to TTX transformation rate

2.3 小鼠法檢測結(jié)果

小鼠生物法檢測 TTX 轉(zhuǎn)化效果如表 1 所示。

由于添加到酒曲中的 TTX 初始濃度很大，為100 mg/L，小鼠被注射后在很短的時(shí)間內(nèi)死亡，表明酒曲中的河豚毒素濃度很大，未能將其降到安全濃度以下。TTX 初始濃度為 10 mg/L時(shí)，與第 2 天相比，第 6 天的小鼠死亡時(shí)間已由 1.5 min 延長為 20 min，雖然對(duì)小鼠的毒性仍較大，但可以看到酒曲對(duì) TTX 的轉(zhuǎn)化有明顯效果。

表1 小鼠生物法測定酒曲對(duì) TTX 轉(zhuǎn)化效果Table1 Effect of distiller's yeast on TTX transformation by mouse bioassay

3 討論

由于自然界河豚魚含毒各器官中 TTX 平均濃度約為 100 mg/L。進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的目的是為了檢測在自然界河豚魚器官中平均濃度的 TTX 溶液對(duì)酒曲中的微生物的生長抑制作用及程度，以此來判斷酒曲中添加 TTX 的濃度。

酒曲對(duì)河豚毒素的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過一段時(shí)間的作用，添加到酒曲中的 TTX 含量在減少，酒曲對(duì)河豚毒素確實(shí)有一定的轉(zhuǎn)化降解作用。對(duì)影響轉(zhuǎn)化降解的因素，如時(shí)間、酒曲投加量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速等進(jìn)行了初步探索，找出了最佳的轉(zhuǎn)化降解條件。生物轉(zhuǎn)化過程中，微生物量對(duì)于 TTX的轉(zhuǎn)化時(shí)間有著重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)中，微生物濃度越低，達(dá)到一定處理效果所需時(shí)間越長，而微生物濃度過高，由于受到包括溶氧量等其他條件的限制，化合物轉(zhuǎn)化速率不再上升。且溫度對(duì)微生物具有廣泛的影響，總體上說，微生物的全部轉(zhuǎn)化過程都取決于化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)速率都受溫度的影響，在最適生長溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度升高，平均轉(zhuǎn)化速率隨之增加，但超過一定限度，會(huì)使酶失活速率也加快。

有關(guān)轉(zhuǎn)化機(jī)理以及 TTX 被轉(zhuǎn)化為何種物質(zhì)，有待于進(jìn)一步研究確定。微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)（底物）轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)（產(chǎn)物）的過程，是通過微生物細(xì)胞將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物代謝過程產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對(duì)底物特定基團(tuán)進(jìn)行的催化反應(yīng)[10]。一般的微生物對(duì)有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)化模式，主要有以下幾種：脫氫反應(yīng)（主要是細(xì)菌）、羥基化反應(yīng)（主要是放線菌）、水解反應(yīng)（主要是細(xì)菌、霉菌、酵母菌）、還原反應(yīng)（主要是酵母菌和霉菌）、?；磻?yīng)（主要是細(xì)菌）、降解反應(yīng)（主要是細(xì)菌）、脫水反應(yīng)（主要是細(xì)菌和霉菌）等。河豚毒素有多種衍生物：脫水河豚毒素、河豚酸、4-表河豚毒素、6-表河豚毒素、4-表-11-脫氧河豚毒素、4,9-脫水-6-表河豚毒素、11-Nor-河豚毒素-6 (R)-ol、11-脫水河豚毒素和 5-脫氧河豚毒素等[11]，但毒性都沒有河豚毒素那么強(qiáng)。無毒的河豚魚體內(nèi)含有河豚毒素衍生物，其對(duì)小鼠沒有致死性，表明該河豚魚是以無毒的河豚毒素衍生物作為前體或代謝產(chǎn)物[12]。

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