虎眼萬年青EST文庫構(gòu)建和Syntaxin基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳 茜，王志標(biāo)，唐 微，王 偉，程克棣，孔建強(qiáng)

虎眼萬年青EST文庫構(gòu)建和Syntaxin基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳 茜，王志標(biāo)，唐 微，王 偉，程克棣，孔建強(qiáng)

目的 構(gòu)建虎眼萬年青 EST 文庫，篩選相關(guān)基因并對其進(jìn)行功能鑒定。

基因文庫； Qa-SNARE 蛋白質(zhì)類； 虎眼萬年青

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(4):247-253

虎眼萬年青（Ornithogalum saundersiae）是原產(chǎn)于南非的觀賞植物，1992 年從中發(fā)現(xiàn)了具有顯著抗癌活性的甾體類皂苷化合物 OSW-1[1]，它對多種惡性腫瘤細(xì)胞都有非常強(qiáng)的抑制作用，是迄今所發(fā)現(xiàn)的抗癌活性極強(qiáng)的化合物之一，其 IC50值在0.1 ～ 0.7 nmol/L 之間，高出臨床應(yīng)用的抗癌藥物[阿霉素（adriamycin）、順鉑（cisplatin）、喜樹堿、絲裂霉素 C 和紫杉醇等] 10 ～ 100 倍，更重要的是它對正常細(xì)胞幾乎沒有抑制作用，具備非常良好的藥用前景[1-2]。然而，由于 OSW-1 在虎眼萬年青中含量極低，限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，尋找一種切實(shí)可行的替代方法來提高虎眼萬年青皂苷產(chǎn)量對于加快其成藥性研究具有非常重要的意義。合成生物學(xué)（synthetic biology）的迅猛發(fā)展給OSW-1 的規(guī)模化制備提供了一個(gè)很好的契機(jī)[3-5]。

合成生物學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)是核酸，克隆天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)功能酶基因以及重要的調(diào)控基因并對其進(jìn)行功能鑒定是進(jìn)行天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的關(guān)鍵一步。基于此，本論文通過 SMART（switching mechanism at 5'end of mRNA template）法構(gòu)建了虎眼萬年青的全長 cDNA 文庫，并利用該文庫篩選到了細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和物質(zhì)分泌重要調(diào)控蛋白之一的 Syntaxin 的編碼基因，對其進(jìn)行了序列分析和初步的表達(dá)研究，從而為進(jìn)一步的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 植物材料 虎眼萬年青鱗莖自澳大利亞引進(jìn)，經(jīng)過誘導(dǎo)后形成愈傷，然后重新誘導(dǎo)出鱗莖。取出無菌鱗莖，放入液氮中速凍，于 -70 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種和試劑 RNeasy plant mini kit 購自德國 Qiagen 公司；大腸桿菌 Trans1-T1、Transetta (DE3) 以及 T-A 克隆時(shí)所用試劑盒 pEASYTMBlunt zero cloning kit 購自北京 Transgen 公司；表達(dá)載體 pET-28a(+) 購自德國 Novagen 公司；KOD-Plus 聚合酶購自日本 Toyobo 公司；鼠源His-Tag 單克隆抗體、酶標(biāo)二抗（山羊抗小鼠 IgG）；IPTG 和卡那霉素購自北京紐樸生物技術(shù)有限公司；快速連接試劑盒 In-FusionTMadvantage PCR cloning kit w/cloning enhancer 試劑盒購自美國Clontech 公司；蛋白 marker 購自立陶宛 Fermentas公司。

大腸桿菌在不加抗生素的 LB 培養(yǎng)基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl）中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化菌株的選擇和誘導(dǎo)在加有 50 μg/ml卡那霉素的 LB 中進(jìn)行。

1.1.3 主要儀器 Mastercycle/5333000.018 高精度梯度 PCR 儀購自德國 Eppendorf 公司；Biospectrum 凝膠成像儀購自美國 UVP 公司；Model 3000Xi 瓊脂糖凝膠電泳儀和 PowerPac 電泳儀均購自美國 Bio-Rad 公司；VCX130 超聲波破碎儀購自美國 Sonics 公司。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 的提取和 cDNA 文庫的構(gòu)建 取50 ～ 100 mg 的虎眼萬年青鱗莖，液氮研磨成粉，采用 CTAB 法提取總 RNA。通過紫外分析儀檢測所提 RNA 的濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。采用 Oligote x mRNA mini kit 純化總 RNA。使用 SMARTTMPCR cDNA synthesis kit合成 cDNA 一鏈和二鏈。使用 QIAquick PCR purification kit 純化擴(kuò)增得到的雙鏈 cDNA，進(jìn)行全長 cDNA 的均一化。均一化的 cDNA 經(jīng) Sfi 酶切后，電泳檢測，將酶切產(chǎn)物的 1 ～ 3 kb 區(qū)域切下，并將產(chǎn)物回收后與 pDNR-LIB 載體連接，將連接產(chǎn)物加到 0.25 μm Millipore 純化膜上脫鹽純化 1 h，電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH10B 中，菌液涂于氯霉素平板上。隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行菌落 PCR 鑒定，電泳檢測插入片段大小及小片段比率。

1.2.2 EST 測序及分析 在 ABI 3730XL 全自動 DNA 測序儀上，隨機(jī)對文庫中的 1440 個(gè)cDNA 克隆進(jìn)行 5′ 末端測序分析，測序通用引物分別為 T7，EST 測序和生物信息學(xué)分析由北京華大基因完成。用 phrap 軟件對 Clean EST 序列進(jìn)行組裝和拼接，得到所測 EST 的相應(yīng) Unigene 數(shù)據(jù)。用 BLASTP（BLASTX）將 Unigene 數(shù)據(jù)與COG（clusters of orthologous groups of proteins）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）進(jìn)行比對分析（期望值標(biāo)準(zhǔn)為 1e ～ 10），獲得虎眼萬年青表達(dá)基因的功能注釋及其 COG 功能分類。

1.2.3 Syntaxin 基因的克隆 從測序的 EST 序列中發(fā)現(xiàn)兩段基因分別與 Syntaxin 43 基因具有同源性，而且推斷可能分別是同一個(gè) Syntaxin 基因的5' 端和 3' 端。因此，設(shè)計(jì)引物 F10343-1/R10343-1和 F10343-2/R10343-2（表 1），以虎眼萬年青 cDNA為模板，通過巢式 PCR 的方法克隆得到一條長約為 1300 bp 的條帶，將其通過平末端連接的方式克隆到載體 pEASYTM-Blunt Zero 中，獲得重組質(zhì)粒pEASY-syntaxin 43，送樣測序。

1.2.4 Syntaxin 蛋白的生物信息學(xué)分析 利用NCBI 的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/orfig.cgi）軟件對擴(kuò)增得到的 cDNA 序列進(jìn)行ORF 分析；利用 Protein Blast（http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PRO GRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW _DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）進(jìn)行Syntaxin 氨基酸的同源性分析；利用 Pfam（http:// pfam.janelia.org/search）程序?qū)寺〉玫降幕蚓幋a蛋白進(jìn)行蛋白家族預(yù)測；用 Expasy 中的工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測Syntaxin 蛋白的理化性質(zhì)；通過 TMpred（http:// www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測 Syntaxin 蛋白的跨膜區(qū)；利用 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對 Syntaxin蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測；采用 TargetP 1.1（http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析預(yù)測 Syntaxin 的細(xì)胞定位。

表1 本實(shí)驗(yàn)中用到的引物Table1 Primers used in this experiment

1.2.5 Syntaxin 基因的表達(dá)和免疫印跡

1.2.5.1 含 Syntaxin 基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建 以 Fet28a10343/Ret28a10343 為引物，pEASY-syntaxin 43 為模板，擴(kuò)增得到的序列與用EcoR I/Hind III 酶切的 pET-28a(+) 進(jìn)行 In-Fusion連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli Trans1-T1，37 ℃ 培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。測序正確的載體命名為pET28a10343，用于原核表達(dá)。其中涉及到的分子生物學(xué)技術(shù)參考文獻(xiàn)[6]，In-Fusion 連接的相關(guān)操作參考 Clontech 公司的說明書。

1.2.5.2 Syntaxin 基因在 E.coli 中的表達(dá)及鑒定 采用 CaCl2法將 pET28a10343 轉(zhuǎn)化到 E.coli Transetta(DE3) 中，篩選正確后，挑取陽性克隆接種到 10 ml 加有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)到 OD600= 0.6 左右，取 1 ml菌液，13 000 × g 離心 1 min，棄上清，沉淀用無菌 ddH2O 涮洗 2 遍，然后轉(zhuǎn)接于加有 50 mg/L卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)至 OD600= 0.6。13 000 × g 離心 1 min，棄上清，沉淀用無菌ddH2O 涮洗 3 遍，然后將沉淀轉(zhuǎn)接于加有 50 mg/L卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中，加入 0.1 mmol/L IPTG，在 16 ℃ 誘導(dǎo) 16 h，取 1.5 ml 菌體，加入裂解液A（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5% 甘油，0.1 mmol/L DTT）300 μl，超聲破碎，13 000 × g 離心 18 min，取上清 15 μl，SDS-PAGE 電泳。

包涵體形式存在的蛋白提取，需在以上步驟，即13 000 × g 離心 18 min 后，棄上清，加入 6 mol/L尿素 50 μl，于 -20 ℃ 沉淀 1 h 后 13 000 × g 離心 18 min，取上清 15 μl，SDS-PAGE 電泳。

1.2.5.3 E.coli 重組 Syntaxin 的蛋白印跡分析 所用一抗為抗 His-Tag 的小鼠單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠 IgG（1∶2000），以帶有 His 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒 pET28a10343 組為實(shí)驗(yàn)組，以pET-28a(+) 空載體組為對照，用 eECL Western blot kid 化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測 Syntaxin 的蛋白表達(dá)。

圖1 菌落 PCR 電泳結(jié)果Figure1 The results of clony PCR

圖2 Syntaxin 基因電泳結(jié)果Figure2 PCR amplification of Syntaxin gene

2 結(jié)果

2.1 虎眼萬年青全長 cDNA 文庫的構(gòu)建

文庫構(gòu)建好后，取 1 μl 菌液涂平板（直徑15 cm），計(jì)算平板上的庫容數(shù)，約為 750個(gè)，通過計(jì)算可以得出菌液滴度為 7.5 × 105cfu/ml。轉(zhuǎn)化菌1.4 ml，所以庫容為 1 × 106，以整個(gè)連接計(jì)算，庫容大于 3 × 106。從文庫中隨機(jī)挑取 24 個(gè)克隆進(jìn)行菌落 PCR 鑒定，電泳結(jié)果見圖 1。結(jié)果顯示，插入片段平均大于 1.5 kb， 且分布在 1 ～ 3 kb 之間。

2.2 EST 分析

對隨機(jī)挑取的 1440 個(gè) cDNA 克隆進(jìn)行測序，獲得 1398 個(gè)有效序列，其中含有 1292 個(gè)高質(zhì)量 EST 序列。利用 Phrap 軟件進(jìn)行 EST 序列組裝，得到單一基因序列（unigene）為 1146 條，其中包括 98 個(gè)重疊群（contig），1048 個(gè)單一 EST序列（singlet）。分析表明，EST 文庫的全長率 54%，冗余率 3.3%。進(jìn)一步的比對分析表明，1146 條虎眼萬年青單一基因序列在 COG 數(shù)據(jù)庫中只有266 個(gè)序列可獲得生物學(xué)功能注釋，因此，如果只采用 COG 一種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，虎眼萬年青鱗莖表達(dá)基因的鑒定率僅為 23% 左右。

2.3 Syntaxin 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

通過巢式 PCR，從虎眼萬年青中分離得到一條長為 1265 bp 的條帶（圖 2），通過生物信息學(xué)分析表明，擴(kuò)增得到的 Syntaxin 基因的 ORF 區(qū)共810 bp，編碼 269 個(gè)氨基酸，5' 非翻譯區(qū)為 145 bp，3' 非翻譯區(qū)為 310 bp。將該序列遞交給 GenBank，獲得注冊號是 KF241989。通過 Protein Blast 分析表明，該基因編碼蛋白和植物的 Syntaxin 同源性較高，而且在植物中比較保守（83.58% 的同源性）（圖 3）。

利用 Pfam（http://pfam.janelia.org/search）程序?qū)寺〉玫降幕蚓幋a蛋白進(jìn)行蛋白家族預(yù)測，結(jié)果表明，該基因最有可能編碼一個(gè) Syntaxin 蛋白（E-value = 6.7E-13），編碼序列中含有一個(gè) SNAREdomain（179 ～ 241 aa）。

通過 ProtParam 對該蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明該蛋白分子式為 C1300H2113N381O423S11，分子量是 30.2 kD，pI = 5.17，該蛋白不穩(wěn)定，是個(gè)親水蛋白（GRAVY = -0.567），提示其可能是膜結(jié)合蛋白。

通過 TMpred 分析，揭示 Syntaxin 有 1 個(gè)跨膜區(qū)域（246 ～ 264 aa），而且 Score值很高，說明Syntaxin 很有可能是一個(gè)跨膜蛋白。蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)提示它可能作為膜受體起作用，也可能是定位于膜的錨定蛋白或者離子通道蛋白等。含有跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)往往和細(xì)胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)，從Syntaxin 的功能來分析，作為膜的錨定蛋白的可能性較大。

利用 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）對 Syntaxin 蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白沒有信號肽，不是一種分泌蛋白，推測該蛋白極有可能是一種膜結(jié)合蛋白，這和TMpred 分析是一致的。采用 TargetP 1.1（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析預(yù)測 Syntaxin的細(xì)胞定位，結(jié)果表明，該蛋白定位于線粒體或分泌途徑的可能性很少（得分分別為 0.074 和0.070），可能定位在其他的細(xì)胞位置，如膜上（得分為 0.936）。

2.4 含 Syntaxin 基因的表達(dá)載體的構(gòu)建

采用快速連接 In-Fusion 技術(shù)將 Syntaxin 基因插入大腸桿菌表達(dá)載體 pET-28a(+) 的多克隆位點(diǎn) EcoR I/Hind III 之間，得到的重組克隆送樣測序。結(jié)果表明，載體構(gòu)建正確，命名為 pET28a10343，含有完整的 Syntaxin 基因。將 pET28a10343 轉(zhuǎn)入大腸桿菌 Transetta(DE3) 中，篩選得到陽性克隆E.coli[pET28a10343]。

2.5 重組 Syntaxin 的 SDS-PAGE 分析

E.coli[pET28a10343]在 16 ℃ 誘導(dǎo) 16 h 后，取 1 ml 菌液，13 000 × g 離心 1 min，棄上清，沉淀超聲破碎后，分別對上清和包涵體進(jìn)行 12% 的SDS-PAGE 分析（圖 4），結(jié)果顯示，經(jīng)過誘導(dǎo)的E.coli[pET28a10343]重組菌上清中誘導(dǎo)條帶不明顯，而包涵體中出現(xiàn)了一條大小為 35 kD 的條帶，而對照未經(jīng)誘導(dǎo)的 E.coli[pET28a10343]沒有出現(xiàn)條帶，初步表明 Syntaxin 基因在 E.coli 中成功表達(dá)，而且是以包涵體形式存在。

2.6 重組 Syntaxin 蛋白的免疫印跡分析

為確證 Syntaxin 基因得到表達(dá)，進(jìn)行了免疫印跡分析。離心收集 E.coli[pET28a10343]的菌體，用超聲破碎液進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，采用 Western blot 進(jìn)行檢測（圖 5）。結(jié)果表明，與對照相比，E.coli[pET28a10343]經(jīng)免疫印跡后，在相應(yīng)的位置上出現(xiàn)了一條相應(yīng)的雜交帶。因此，確認(rèn)重組的Syntaxin 蛋白具有特異的免疫活性，表明 Syntaxin基因在 E.coli 中得到了表達(dá)。

圖4 重組 Syntaxin 的 SDS-PAGE 結(jié)果Figure4 Expression of recombinant Syntaxin protein

圖5 E.coli 重組 Syntaxin 蛋白的 Western blot 結(jié)果Figure5 Western blot analysis of rexombinant Syntaxin protein

3 討論

Syntaxin 是 SNARE（soluble N-ethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptor）復(fù)合物中最重要的組成成分[7-8]，參與調(diào)控細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和物質(zhì)分泌過程，在介質(zhì)質(zhì)膜的導(dǎo)向、錨定、融合和胞吐作用中起著核心作用，是參與調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫炎性細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)或炎性介質(zhì)不可少的結(jié)構(gòu)和功能單位。和動物中的 Syntaxin 的研究相比，植物中 Syntaxin 的研究相對較少?，F(xiàn)在已知 Syntaxin 在植物中成員眾多[9]，參與了多種生理作用。Syntaxin 蛋白通過和 SNARE 蛋白相互作用，參與植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的融合[10-11]，此外，Syntaxin 還參與了植物抗病[12-13]等生理過程，因此開展針對植物 Syntaxin 基因的研究具有很重要的意義。

在本項(xiàng)目中，全長 Syntaxin 基因的克隆方法對今后利用該文庫篩選其他基因具有借鑒意義。在本論文中，我們從 EST 文庫中分別得到了兩條和Syntaxin 具有同源性的片段，如何判斷這兩條片段是否屬于同一基因，對于能否快速獲得全長該基因很重要。如果推斷這兩條片段不屬于同一個(gè)基因，則需要通過 RACE 將 Syntaxin 基因缺失的部分?jǐn)U增出來，需要花費(fèi)一定的時(shí)間。而如果能有效地判斷這兩個(gè)片段屬于同一個(gè)基因，則只需根據(jù)這兩個(gè)片段序列，設(shè)計(jì)特異的引物，通過常規(guī)巢式 PCR就能快速地克隆得到我們需要的全長 cDNA，由此看來，通過生物信息學(xué)對兩個(gè)片段是否屬于同一個(gè)基因是快速克隆該全長基因的前提。在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過 Blast Protein 對這兩個(gè)序列分別進(jìn)行同源序列查找，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)序列和同一個(gè)已知氨基酸序列的同源性近似相等，而且，GC 含量分析表明，這兩個(gè)片段的 GC 含量比較相似，根據(jù)這兩點(diǎn)，初步判斷這兩個(gè)序列分別屬于同一個(gè)Syntaxin 基因的 5' 和 3' 端。我們據(jù)此設(shè)計(jì)了特異的引物，通過常規(guī) RT-PCR，快速地克隆得到了該Syntaxin 基因。

在本實(shí)驗(yàn)中，Syntaxin 的理論分子量是 30 kD，而通過 SDS-PAGE 分析表明 Syntaxin 的分子量是 35 kD，之所以造成 Syntaxin 重組蛋白大小出現(xiàn)差異的原因前人早有分析[14]，推測可能是pET-28(+) 上的 His- 標(biāo)簽對重組蛋白產(chǎn)生影響，導(dǎo)致分子量和理論值出現(xiàn)差異。

[1] Kubo S, Mimaki Y, Terao M, et al. Acylated cholestane glycosides from the bulbs of Ornithogalum saundersiae. Phytochemistry, 1992, 31(11):3969-3973.

[2] Mimaki Y, Kuroda M, Kameyama A, et al. Cholestane glycosides with potent cytostatic activities on various tumor cells from Ornithogalum saundersiae bulbs. Bioorg Med Chem Lett, 1997, 7(5):633-636.

[3] Benner SA, Sismour AM. Synthetic biology. Nat Rev Genet, 2005, 6(7):533-543.

[4] Sismour AM, Benner SA. Synthetic biology. Expert Opin Biol Ther, 2005, 5(11):1409-1414.

[5] Parens E, Johnston J, Moses J. Ethics. Do we need "synthetic bioethics"? Science, 2008, 321(5895):1449.

[6] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning a laboratory manunal. Jin DY, Li MF, translate. 2nd. Beijing: Science Press, 1992. (in Chinese)

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 等. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南. 金冬雁, 黎孟楓, 譯. 2版. 北京: 科學(xué)出版社, 1992.

[7] Peng L, Liu H, Ruan H, et al. Cytotoxicity of botulinum neurotoxins reveals a direct role of syntaxin 1 and SNAP-25 in neuron survival. Nat Commun, 2013, 4:1472.

[8] Zhou P, Pang ZP, Yang X, et al. Syntaxin-1 N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion. EMBO J, 2013, 32(1):159-171.

[9] Touihri S, Kn?ll C, Stierhof YD, et al. Functional anatomy of the Arabidopsis cytokinesis-specific syntaxin KNOLLE. Plant J, 2011, 68(5):755-764.

[10] Jahn R, Scheller RH. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006, 7(9):631-643.

[11] Lipka V, Kwon C, Panstruga R. SNARE-ware: the role of SNARE-domain proteins in plant biology. Annu Rev Cell Dev Biol, 2007, 23:147-174.

[12] Eschen-Lippold L, Landgraf R, Smolka U, et al. Activation of defense against phytophthora infestans in potato by down-regulation of syntaxin gene expression. New Phytol, 2012, 193(4):985-996.

[13] Nielsen ME, Feechan A, B?hlenius H, et al. Arabidopsis ARF-GTP exchange factor, GNOM, mediates transport required for innate immunity and focal accumulation of syntaxin PEN1. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(28):11443-11448.

[14] Tang WH, Zhang JL, Wang ZY, et al. The cause of deviation made in determining the molecular weight of His-tag fusion proteins by SDS-PAGE. Acta Phytophysiologica Sinica, 2000, 26(1):64-68. (in Chinese)

唐威華, 張景六, 王宗陽, 等. SDS-PAGE法測定His-tag 融合蛋白分子量產(chǎn)生偏差的原因. 植物生理學(xué)報(bào), 2000, 26(1):64-68.

Construction and characterization of normalized full-length cDNA library and gene cloning of Syntaxin from Ornithogalum saundersiae

CHEN Xi, WANG Zhi-biao, TANG Wei, WANG Wei, CHENG Ke-di, KONG Jian-qiang

Objective Construction of Ornithogalum saundersiae EST library to facilitate the gene screening and functional characterization. Methods The total RNA of Ornithogalum saundersiae was isolated by CTAB method. A normalized full-length cDNA library, with titer of above 3 × 106cfu/ml, was established by the method of SMART using the total RNA of young bulb of Ornithogalumsaundersiae as the template. Sequencing analysis of 1440 clones, which were selected randomly from the constructed EST library of Ornithogalum saundersiae was performed. Blast analysis (NR, NT, Swiss-Prot and KEGG) and COG function classification were done using the acquired EST sequences.Results The average size of cDNA inserts was 1500 bp with a redundancy rate of 3.3%. Meanwhile a total of 1146 unigenes were attained by sequencing. These results indicated that the normalized full-length cDNA library was established successfully. Two cDNA sequences, similar to Syntaxin gene, were screened from cDNA library. Blast analysis showed the two sequences were probably the 5' and 3' sequence of the same Syntaxin gene. Two pairs of primers based on the specific Syntaxin gene were synthesized. The full-length Syntaxin gene was isolated from Ornithogalum saundersiae by standard RT-PCR. The Syntaxin gene was cloned into the E.coli expression vector pET-28a(+) and the recombinant E.coli containing Syntaxin gene was induced to express by IPTG addition. SDS-PAGE and Western blot results indicated that the Syntaxin gene was successfully expressed in E.coli.Conclusion The Ornithogalum saundersiae EST library was successfully constructed. A full long cDNA similar to Syntaxin gene was isolated from Ornithogalum saumdersiae and then heterologous expression in E.coli was performed successfully, which laid the foundation for further functional characterization of Syntaxin gene in the future.

Gene library; Qa-SNARE proteins; Ornithogalum saundersiae

KONG Jian-qiang, Email: jianqiangk@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.002

天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)秀青年人才基金（B-2011-4）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（陳茜、王志標(biāo)、王偉、程克棣、孔建強(qiáng)）；430071 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（陳茜、唐微）

孔建強(qiáng)，Email：jianqiangk@imm.ac.cn

2013-03-15

方法 CTAB 法提取虎眼萬年青鱗莖總 RNA，通過SMART 方法構(gòu)建全長 cDNA 文庫，獲得庫容大于 3 × 106cfu/ml 的均一化全長 cDNA 文庫。隨機(jī)挑取 1440 個(gè)單克隆測序，并對得到的 EST 序列進(jìn)行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分類。

結(jié)果 獲得 1398 條有效 EST 序列，含有 1146 條單一基因，cDNA 文庫平均插入片段長度在 1.5 kb 以上，全長率54%，冗余率 3.3%。其中兩段基因都與 Syntaxin 43 基因相似，同源性分別為 76% 和 89%，根據(jù) Blast 比對結(jié)果，推斷這兩個(gè)基因片段是同一個(gè) Syntaxin 基因的 5' 端和 3' 端。據(jù)此設(shè)計(jì)引物，以虎眼萬年青 cDNA 為模板，通過常規(guī)的 RT-PCR 擴(kuò)增得到全長 Syntaxin 基因，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體，接著導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 和 Western blot 證實(shí)該基因在大腸桿菌獲得表達(dá)。

結(jié)論 首次構(gòu)建成功虎眼萬年青 EST 文庫；并從中篩選得到一條和 Syntaxin 具有同源性的基因，實(shí)現(xiàn)了 Syntaxin 蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，為 Syntaxin 基因功能的鑒定奠定基礎(chǔ)。

Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (CHEN Xi, WANG Zhi-biao, WANG Wei, CHENG Ke-di, KONG Jian-qiang); School of Medicine of Wuhan University, Wuhan 430071, China (CHEN Xi, TANG Wei)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):247-253