同源區(qū)段長度對In-Fusion技術(shù)連接效率的影響

李慧仙，朱 平

·論著·

同源區(qū)段長度對In-Fusion技術(shù)連接效率的影響

李慧仙，朱 平

目的 在目的基因原載體（DNA 模板）與克隆載體相同的條件下，探討了 PCR 擴增片段（含目的基因）的末端與載體間同源區(qū)段長度對 In-Fusion 連接效率的影響，并建立以In-Fusion 技術(shù)為基礎(chǔ)的高通量克隆方法。

定向分子進化； In-Fusion 技術(shù)； 同源區(qū)段； 高通量克隆

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(4):241-246

近年來發(fā)展起來的高通量克隆技術(shù)廣泛應用于定向進化、結(jié)構(gòu)基因組學等研究[1-2]，它不依賴于酶切連接，克服了常規(guī)酶切連接法效率低下、載體自連程度高等因素的限制，尤其適用于較大基因片段的高效克隆[3]。根據(jù)連接方式的不同，又可分為以下兩類：①依賴于 PCR 的連接，例如POE-PCR 技術(shù)（prolonged overlap extension PCR）[4]、MEGAWHOP 技術(shù)（megaprimer PCR of whole plasmid）[5]等。該類方法均基于 PCR 進行全長質(zhì)粒擴增，陽性重組率可高達 100%，但是連接成功率取決于兩片段能否成功退火，以及在第二輪 PCR中能否有效去除前一輪所用引物，通常技術(shù)要求高，不具有應用普遍性；②依賴于同源重組酶的連接，例如 Gateway 技術(shù)（Invitrogen）[6]、In-Fusion技術(shù)（Clontech）[7]等。Gateway 技術(shù)是基于 λ 噬菌體位點特異重組系統(tǒng)，由 BP 和 LR 兩個反應構(gòu)成，兩個反應的陽性重組率均可高達 90% 以上，但會引入多余序列。該技術(shù)需要特殊含 attR 位點表達載體，Invitrogen 公司提供一系列常用 attR 位點修飾后的表達載體，此外，還可以將目的載體改造成為 Gateway 表達載體。該技術(shù)最大的優(yōu)勢在于通過 BP 反應構(gòu)建入門載體后，通過 LR 反應就可以使插入片段在不同表達載體間快速準確穿梭，便于功能基因的分析和蛋白的表達。In-Fusion技術(shù)是依賴于 In-Fusion 酶 3' → 5' 外切酶活性，經(jīng)短時間即可在插入片段與載體的同源區(qū)段（homologous or over-lapping sequence）上形成互補的單鏈黏端，繼而在單鏈黏端之間自發(fā)退火形成重組質(zhì)粒。In-Fusion 技術(shù)適用于任何載體，不需對載體進行改造，也不會引入多余序列，在設(shè)計基因片段的上、下游引物時，兩引物的 5'-末端分別僅需要 15 個堿基與載體序列相同[8]。值得注意的是，與 Gateway 技術(shù)相比，In-Fusion 技術(shù)連接時只需要一步，在定向進化突變庫構(gòu)建應用中降低了多步驟連接帶來的庫容量與豐度的損失。

但在應用 In-Fusion 技術(shù)進行基因克隆時，15 bp 的同源區(qū)段長度對于大片段 DNA 的克隆還存在陽性重組率有所減低的問題[9-10]。Sleight 等[11]發(fā)現(xiàn)增加同源區(qū)段的長度可以提高陽性重組率，但同源區(qū)段增加多長為宜尚沒有明確的答案。另外，無限制地增加同源區(qū)段長度也會因引物的加長而增加引物合成成本。能否在不增加引物長度的前提下，也能增加同源區(qū)段長度并大幅度提高陽性重組率？這一問題在進行定向進化研究時是可以解決的，條件是克隆前后所用的載體要相同，至少在克隆位點附近的序列要前后一致。即在應用易錯 PCR（error-prone PCR）或 DNA 改組等技術(shù)進行 PCR擴增時，選取目的基因兩側(cè)的載體序列按常規(guī)方法設(shè)計出一般長度的引物，載體序列距離目的基因越遠，則同源區(qū)段長度越長。我們在構(gòu)建糖基水解酶Lxyl-p1-2 基因突變庫時目的基因長度為 2412 bp，實驗發(fā)現(xiàn)最適同源區(qū)段長度大約為 100 bp，此時的陽性重組率高達 90% 左右，遠高于同源區(qū)段為15 ～ 50 bp 的陽性重組率。但若再繼續(xù)增加同源區(qū)段長度則無明顯的效果。本文對上述實驗結(jié)果做重點介紹。

圖1 In-Fusion 技術(shù)構(gòu)建糖基水解酶 Lxyl-p1-2 基因突變庫示意圖（A：引物在原載體上的同源部位；B：In-Fusion 一步法連接；C：重組質(zhì)粒 BamH I/Not I 酶切鑒定）Figure1 Schematic diagram of construction of Lxyl-p1-2 mutant library by In-Fusion technique (A: Homologous positions of the primers on the original vector; B: One-step ligation by In-Fusion enzyme; C: Restriction analysis of the recombinant plasmids by BamH I/Not I)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Dpn I、Taq DNA 聚合酶、PCR 試劑購自NEB；DNA marker、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；In-Fusion PCR 克隆試劑盒購自淮安百慧生物科技有限公司；引物由 Invitrogen 公司合成；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌 E.coli TG1 由本實驗室保存。重組質(zhì)粒 pPIC3.5K-LXYL-P1-2 由本實驗室構(gòu)建，巴斯德畢赤酵母 Pichia pastoris GS115、載體 pPIC3.5K 購自 Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 In-Fusion 技術(shù)的核心是設(shè)計引物使目的基因的 5'-末端分別與線性化載體末端至少含有 15 bp 同源序列。如圖 1A 所示，根據(jù)目的基因兩側(cè)的載體區(qū)域設(shè)計引物，引物的同源序列距離目的基因越遠，則擴增得到的 DNA 片段與載體的同源區(qū)段越長。所用的上/下游引物序列見表 1，其同源區(qū)段的長度分別為：15、25、50、100、150和 200 bp。

1.2.2 Lxyl-p1-2 的易錯 PCR 擴增 以含Lxyl-p1-2 基因的重組質(zhì)粒 pPIC3.5K-LXYL-P1-2為模板，進行易錯 PCR 擴增。50 μl 反應體系含有：1 × Taq DNA 聚合酶緩沖液、0.2 mol/L dATP 和dCTP、1 mol/L dGTP 和 dTTP、7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2、上下游引物各 0.4 μmol/L、模板 DNA 1 ng、Taq DNA 聚合酶 3U。PCR 擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

易錯 PCR 擴增產(chǎn)物命名為 Lxyl-p1-2-ep， Dpn I 消化以徹底去除原始模板質(zhì)粒 pPIC3.5KLXYL-P1-2[12]。

1.2.3 In-Fusion 連接反應摩爾比的優(yōu)化 將目的基因和限制性內(nèi)切酶 BamH I/Not I 雙酶切處理的線性化載體按照摩爾比 1∶1、3∶1、5∶1 和 10∶1 的梯度混合均勻，目的基因兩端的序列和載體序列間同源區(qū)段長度為 15 bp，各梯度載體總量相同，均為 100 ng，加入 In-Fusion 酶 3 μl，補足水至10 μl，25 ℃ 反應 30 min。取 5 μl 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TG1 感受態(tài)細胞，均勻涂布于 LB（含100 μg/ml Amp）固體培養(yǎng)基上，37 ℃ 過夜培養(yǎng)。陽性重組率通過菌落 PCR 測定，以確定最優(yōu)摩爾比連接體系。

重組子的篩選：從 LB（含 100 μg/ml Amp）平板上挑取單菌落，利用 pPIC3.5K 序列引物5'AOX1 和 3'AOX1 進行菌落 PCR，鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。PCR 擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃10 min。

表1 本研究所用的引物及其序列Table1 The primers and the sequences utilized in this study

定義：陽性重組率（%）=（菌落 PCR 鑒定陽性的單菌落數(shù)/LB 板上的全部單菌落數(shù)）× 100%。

1.2.4 In-Fusion 克隆時同源區(qū)段長度對陽性重組率的影響 為考察不同長度同源區(qū)段對陽性重組率的影響，利用表 1 所示的上/下游引物進行 PCR擴增，將擴增產(chǎn)物分別與線性化載體通過 In-Fusion連接，取 5 μl 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TG1 感受態(tài)細胞。陽性重組率通過菌落 PCR 測定，比較不同長度同源區(qū)段間陽性重組率的差異。

1.2.5 In-Fusion 法與常規(guī)酶切連接法陽性重組率的比較 分別運用常規(guī)酶切連接法與 In-Fusion 法構(gòu)建 Lxyl-p1-2 基因的突變庫，比較兩種方法的陽性重組率。

重組質(zhì)粒 pPIC3.5K-LXYL-P1-2 和載體pPIC3.5 分別用 BamH I/Not I 雙酶切處理，分別回收目的基因片段（切膠回收）和載體片段（乙醇沉淀回收）。

T4 連接：酶切回收基因片段和載體 pPIC3.5K酶切片段按照摩爾比 5∶1 混合均勻，載體的量為100 ng，T4 DNA ligase 1 μl，10 × T4 DNA ligase Buffer 2 μl，水補至 20 μl，16 ℃ 連接 3 h。取 5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TG1 感受態(tài)細胞。陽性重組率通過菌落 PCR 測定。

2 結(jié)果

2.1 Lxyl-p1-2 的易錯 PCR 擴增

以含 Lxyl-p1-2 基因的重組質(zhì)粒 pPIC3.5KLXYL-P1-2 為模板，引物 15-F/15-R、25-F/25-R、50-F/50-R、100-F/100-R、150-F/150-R 和 200-F/ 200-R 通過易錯 PCR 擴增分別得到理論值大小為2442、2462、2512、2612、2712 和 2812 bp 的Lxyl-p1-2-ep 基因片段（擴增片段上下游與載體分別含有 15、25、50、100、150 和 200 bp 的重疊序列）（圖 2）。

圖2 易錯 PCR 擴增 Lxyl-p1-2 片段電泳圖Figure2 Electrophoresis of error-prone PCR product of Lxyl-p1-2

2.2 In-Fusion 連接反應摩爾比的優(yōu)化

插入片段與載體的不同摩爾比，結(jié)果如圖 3所示。在插入片段與載體的比例為 1∶1、3∶1、5∶1和 10∶1 的梯度中，載體的量均為 100 ng。隨著插入片段與載體摩爾比的增加，陽性重組率上升明顯，當摩爾比增加到 5∶1 時達到峰值，此為最佳摩爾比。

圖3 插入片段和載體不同摩爾比陽性重組率比較Figure3 Positive recombinant ratio of In-Fusion assembly using different molar ratio

圖4 同源區(qū)段長度對 In-Fusion 法重組效率的影響Figure4 Influence of different lengths of the over-lapping sequences on the In-Fusion recombination efficiency

2.3 含有目的基因的重組片段與載體同源區(qū)段長度對 In-Fusion 陽性重組率的影響

含有目的基因的重組片段與載體間不同長度同源區(qū)段對陽性重組率的影響，結(jié)果如圖 4 所示：當同源區(qū)段長度為 15 ～ 50 bp 時，陽性重組率不高；當同源區(qū)段長度為 100 bp 時，陽性重組率為80% ～ 90%，達到最高值；此時如果再繼續(xù)增加同源區(qū)段長度到 150 ～ 200 bp 時，陽性重組率則不再上升。故可選擇長度為 100 bp 的同源區(qū)段進行In-Fusion 高通量克隆和構(gòu)建突變庫，具有進行后續(xù)操作的可行性。

由圖 4 可知，傳統(tǒng)酶切連接法的陽性重組率僅為 25% ～ 30%，明顯低于 In-Fusion 方法的所有實驗組，其中，In-Fusion 法同源區(qū)段長度為 100 bp組的陽性重組率是傳統(tǒng)酶切連接法的 3 倍，而且，與傳統(tǒng)酶切連接法通常需要 3 ～ 4 d 相比，In-Fusion 法建庫只需 1 ～ 2 d 時間。

3 討論

In-Fusion 技術(shù)是近年來新興的一種克隆方法，已逐漸應用于長片段 DNA 克隆、多片段克隆和基因突變等研究中[13-14]。在常規(guī)的 In-Fusion 技術(shù)中，15 bp 的同源區(qū)段長度足以滿足一般小片段克隆對陽性重組率的要求，例如，Irwin等[9]證實利用In-Fusion 技術(shù)將 N2L 基因（553 bp）成功插入到pETBlue-2 載體中，陽性重組率可達 99%。Benoit等[10]探討了不同長度的 DNA 片段（447 ～ 1200 bp）與不同長度的載體（2824 ～ 5434 bp）間陽性重組率的差別，發(fā)現(xiàn)長插入片段與短插入片段相比，陽性重組率較低，且不同大小的插入片段與同樣大小的載體間陽性重組率存在較大差異（25% ～ 100%）。我們的實驗結(jié)果證實：同源區(qū)段長度成為影響陽性重組率的重要因素，長片段同源區(qū)段與短片段同源區(qū)段相比，陽性重組效率上升明顯，這與 Sleight等[11]研究一致。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，對于長度為2.4 kb 的目的基因來說，當 PCR 擴增得到的重組片段與載體的同源區(qū)段增加到 100 bp 時，與同源區(qū)段為 15 ～ 50 bp 相比，陽性重組率提高至 80% ～90%。

本研究應用 In-Fusion 技術(shù)構(gòu)建糖基水解酶Lxyl-p1-2 基因突變庫。構(gòu)建的重組載體經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定證實易錯 PCR 擴增的片段Lxyl-p1-2-ep 被成功插入載體中?，F(xiàn)已累計測序超過 100 個克隆，均未發(fā)生連接區(qū)的堿基突變。目前正進行突變庫的篩選工作，已從 2000 株克隆中篩選到 2 株酶活性顯著提高的突變株 EP1 和EP2，其酶活性分別比野生型對照增加 0.57 和1.21 倍。在應用易錯 PCR 或 DNA 改組等方法進行定向進化研究時，采用 In-Fusion 技術(shù)進行建庫簡便、快速，只需要 PCR、載體酶切和 In-Fusion 連接過程，省略了常規(guī)酶切連接法構(gòu)建過程中亞克隆連接、質(zhì)粒提取、基因片段與載體酶切、T4 DNA 連接酶連接等多步煩瑣且耗時的工作，將建庫周期由3 ～ 4 d 縮短為 1 ～ 2 d。另外，一步連接也降低了亞克隆步驟帶來的突變基因容量與豐度的損失。本研究關(guān)于同源區(qū)段長度的實驗結(jié)果，對于利用該技術(shù)進行類似大片段 DNA 的克隆具有借鑒意義，今后要更加關(guān)注大于 2.4 kb 長度的基因片段的連接效率，以檢驗該方法的適用范圍。

[1] Festa F, Steel J, Bian X, et al. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics, 2013, 13(9): 1381-1399.

[2] Kumar A, Singh S. Directed evolution: tailoring biocatalysts for industrial applications. Crit Rev Biotechnol, 2012.

[3] You C, Percival Zhang YH. Easy preparation of a large-size random gene mutagenesis library in Escherichia coli. Anal Biochem, 2012, 428(1):7-12.

[4] You C, Zhang XZ, Zhang YH. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(5):1593-1595.

[5] Miyazaki K. MEGAWHOP cloning: a method of creating random mutagenesis libraries via megaprimer PCR of whole plasmids. Methods Enzymol, 2011, 498:399-406.

[6] Gruet A, Longhi S, Bignon C. One-step generation of error-prone PCR libraries using Gateway? technology. Microb Cell Fact, 2012, 11:14.

[7] Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S, et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res, 2007, 35(6): e45.

[8] Berrow NS, Alderton D, Owens RJ. The precise engineering of expression vectors using high-throughput In-Fusion PCR cloning. Methods Mol Biol, 2009, 498:75-90.

[9] Irwin CR, Farmer A, Willer DO, et al. In-fusion? cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods Mol Biol, 2012, 890:23-35.

[10] Benoit RM, Wilhelm RN, Scherer-Becker D, et al. An improved method for fast, robust, and seamless integration of DNA fragments into multiple plasmids. Protein Expr Purif, 2006, 45(1):66-71.

[11] Sleight SC, Bartley BA, Lieviant JA, et al. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering. Nucleic Acids Res, 2010, 38(8):2624-2636.

[12] Bryksin AV, Matsumura I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques, 2010, 48(6):463-465.

[13] Zhu B, Cai G, Hall EO, et al. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques, 2007, 43(3):354-359.

[14] Kushnir S, Marsac Y, Breitling R, et al. Rapid production of functionalized recombinant proteins: marrying ligation independent cloning and in vitro protein ligation. Bioconjug Chem, 2006, 17(3): 610-617.

Effect of the length of homologous sequence on the In-Fusion recombination efficiency

LI Hui-xian, ZHU Ping

Objective To explore the effect of length of homologous sequence between the ends of PCR amplicon (harboring the targeted gene) and the vector on the In-Fusion recombination efficiency, when the template vector is the same as the cloning vector, and to establish an efficient high-throughput cloning method based on In-Fusion technique.Methods With construction of the mutant library of the glycoside hydrolase Lxyl-p1-2 (2.4 kb) as an example, different primers were designed on the basis of the various positions of the vector. The PCR fragments (each harboring the targeted gene) were obtained by error-prone PCR. Each fragment contained two over-lapping sequences (15 - 200 bp in length) at the two ends with each of the corresponding ends of the linearized vector. These PCR amplicons were directionally cloned into the vector pPIC3.5K by In-Fusion technique.Results For the cloning of the 2.4 kb DNA fragments by the In-Fusion method, the highest DNA ligation efficacy was obtained when the over-lapping sequence between the PCR fragments and the linearized vector at any end was 100 bp in length, with the highest recombination rate of around 90%. The recombination rate was three times higher than that of the conventional restriction enzyme cloning method. Moreover, the cloning period was drastically shortened from 3 - 4 d of the conventional method to 1 - 2 d of the present method.Conclusion The optimized length of homologous sequence obtained in this paper may significantly increase the ligation efficacy between the 2.4 kb targeted gene and the vector when the In-Fusion technique was applied. The method is particularly suitable to construct the mutant library in the study of directed evolution.

Directed molecular evolution; In-Fusion technique; Homologous sequence; High-throughput cloning

ZHU Ping, Email: zhuping@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.001

國家自然科學基金（31270796）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001-005）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（2012N06）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室/衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室

朱平，Email：zhuping@imm.ac.cn

2013-04-22

方法 以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突變庫的構(gòu)建為例，設(shè)計引物使目的基因的兩端分別與線性化載體末端含有 15 ～ 200 bp 重疊序列，并通過易錯 PCR 方法獲得含目的基因的 PCR 擴增片段，運用 In-Fusion 技術(shù)將 PCR 擴增片段定向克隆至表達載體 pPIC3.5K 中。

結(jié)果 對于長度大約為 2.4 kb 的較大片段 DNA 的克隆，PCR 擴增片段的末端與載體間最適同源區(qū)段長度約為100 bp，此時連接效率最高，其陽性重組率高達 90% 左右，是常規(guī)酶切連接法的 3 倍。與后者相比，該技術(shù)將克隆周期由 3 ～ 4 d 縮短為 1 ～ 2 d。

結(jié)論 優(yōu)化的同源區(qū)段長度可以顯著提高 In-Fusion 技術(shù)對于 2.4 kb 目的基因與載體的連接效率，該方法尤其適用于定向進化過程中基因突變庫的構(gòu)建。

Author Affiliat ion: State Key Laboratory of Active Substance and Function of Natural Medicines/ Ministry of Health Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):241-246