雙孢蘑菇工業(yè)化生產(chǎn)液體菌種繁育條件的優(yōu)化*

宋德龍，贠建民，艾對元，張紊瑋，魏龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

我國雙孢蘑菇產(chǎn)量和出口量居世界第一位，但目前生產(chǎn)方式仍比較落后［1－3］。菌種生產(chǎn)多采用固體逐級擴大培養(yǎng)方式，菌種的純度低、生長周期長、菌齡不一致，且菌種生產(chǎn)成本較高。隨著食用菌栽培工廠化進程的不斷推進，這種食用菌制種方式已不能滿足其規(guī)?；母咝г耘嘈枰顚影l(fā)酵技術(shù)則可以解決以上問題［4－7］。近幾年，我國液體菌種生產(chǎn)伴隨著食用菌工業(yè)化的發(fā)展也取得了很大的進步［8］，但在西北地區(qū)食用菌液體菌種生產(chǎn)與應(yīng)用還存在著一些制約因素，諸如液體菌種生產(chǎn)過程對無菌程度控制要求很高、對設(shè)備的依賴性和投入較大、對操作人員的技術(shù)素養(yǎng)要求也較高，存在的染菌風險也相應(yīng)高［9］。為適應(yīng)新形勢下的食用菌大規(guī)模工廠化栽培的需求，特別是液體菌種均勻化噴灑播種模式的要求，本文擬對雙孢蘑菇As2796菌株進行液體振蕩培養(yǎng)，通過優(yōu)化液體菌種培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，有效控制液體菌種菌絲球的直徑和密度，旨在獲得一種適合于雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)中可進行管道自動化噴灑播種的液體菌種，為雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)制備液體菌種提供理論依據(jù)，并為食用菌栽培提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus imbach)As2796菌株，由蘭州科泰現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，pH 自然，用于菌種斜面培養(yǎng)。

查閱文獻資料和企業(yè)多年生產(chǎn)驗證的配方［10－11］，獲得以下4種一級液體種子培養(yǎng)基:

(1)MgSO4· 7H2O 0.5 g、KH2PO40.46 g、K2HPO41 g、蛋白胨 2 g、酵母浸膏 2 g、葡萄糖 20 g、水1 000 mL，pH自然;

(2)玉米淀粉 30 g、蔗糖 20 g、酵母粉 5 g、Mg-SO4·7H2O 1 g、KH2PO41.5 g、VB10.01 g、水 1 000 mL，pH 自然;

(3)馬鈴薯80 g、紅糖 12 g、葡萄糖 9.0 g、蛋白胨 2 g、酵母膏 1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、VB10.01 g、水 1 000 mL，pH 自然;

(4)玉米淀粉 30 g、蔗糖 20 g、蛋白胨 5 g、Mg-SO4·7H2O 1 g、KH2PO41.5 g、VB10.01 g、水 1 000 mL，pH 自然;

二級液體種子培養(yǎng)基［10］:玉米淀粉31.7 g、豆餅粉 11.3 g、MgSO4·7H2O 3.5 g、KH2PO42.5 g、CaCl27.5 g、NaCl 6.5 g、水 1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1.3.1.1 菌種活化

從保藏的斜面試管菌種中切出1 cm2大小的菌種塊接種于PDA斜面的中部，25℃恒溫培養(yǎng)25 d。

1.3.1.2 一級液體種子培養(yǎng)

將活化的母種分割成約2 cm2大小的菌塊，接種到液體培養(yǎng)基中，一個250 mL三角瓶接2塊菌種，先在25℃靜置48 h，然后振蕩培養(yǎng)7 d左右，獲得一級液體種子(搖瓶菌種)。搖瓶培養(yǎng)條件:250 mL三角瓶裝液量100 mL，在25℃，150 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d左右。

1.3.1.3 二級液體種子培養(yǎng)

將搖瓶菌種在25℃靜置48 h后，用均漿器將其均漿。250 mL三角瓶裝入二級液體種子培養(yǎng)基100 mL，接入10%一級液體種子，在25℃，150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)14 d左右。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 菌絲球生物量的測定［12］

搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液置于離心機中，3 000 r/min離心20 min，取沉淀用分析天平稱重。

1.3.2.2 菌絲球直徑的測定［3，10］

隨機取菌絲球20個，成直線排列，測其總長度，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2.3 菌絲球密度的測定［10］

取5 mL的發(fā)酵液，按比例在量筒中加水稀釋，搖勻后取1 mL在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中攤勻，培養(yǎng)皿下墊黑白相間的格紙，用方格計數(shù)法計數(shù)。

1.3.2.4 pH值的測定

取培養(yǎng)液，采用精密pH計直接測量。

1.3.2.5 還原糖的測定［13］

3，5-二硝基水楊酸法(DNS)測定。

1.3.2.6 氨基氮的測定［13］

用甲醛滴定法測定。

1.3.3 液體菌種繁育條件優(yōu)化設(shè)計

1.3.3.1 一級液體種子培養(yǎng)基的篩選

從1.2所列4種培養(yǎng)基配方中優(yōu)選一級液體種子培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基做3個重復(fù)，相同條件下?lián)u床培養(yǎng)，通過觀察記錄液體菌種的菌絲萌發(fā)的速度、培養(yǎng)液澄清度、菌絲球大小和數(shù)量、雜菌污染、菌絲球生物量等情況，從而優(yōu)選搖瓶菌種培養(yǎng)基。

1.3.3.2 二級液體種子培養(yǎng)條件單因素試驗

對液體培養(yǎng)條件溫度、初始pH、接種量、裝液量進行單因素篩選試驗，考察各因素對雙孢蘑菇液體菌種培養(yǎng)的影響，以確定最適單因素條件。

1.3.3.3 二級液體種子培養(yǎng)條件正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，從每個影響因素中選出對液體菌種繁育影響最大的3個水平，采取正交表L9(34)安排正交實驗(表1)，以菌絲體生物量為指標。

表1 培養(yǎng)條件正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal designs of culture conditions

1.3.3.4 液體菌種培養(yǎng)周期的確定［13］

在上述研究結(jié)果基礎(chǔ)上，對液體制種過程中培養(yǎng)液的各主要理化指標變化進行動態(tài)跟蹤，從接種后第3天開始取樣測定，每2天測1次，主要測量指標為生物量、還原糖、pH值、氨基氮，每次做3個重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢蘑菇一級液體種子培養(yǎng)基不同配方的篩選

雙孢蘑菇一級液體種子培養(yǎng)基不同配方的菌絲生長情況見表2。

表2 雙孢蘑菇一級液體種子培養(yǎng)基不同配方的菌絲生長情況Table 2 Mycelium growth of Agaricus bisporus Primary liquid seed in different medium formulations

從表2可以看出，雙孢蘑菇在4種液體種培養(yǎng)基配方中均可生長。菌絲生物量分別為:(1)13.969 mg/mL，(2)25.408 mg/mL，(3)37.610 mg/mL，(4)19.203 mg/mL。其中配方(3)效果較好，菌絲萌發(fā)快，菌絲球多而均勻，更適合做液體種子;配方(2)次之;而配方(1)和配方(4)則較差，菌絲量少且不均勻。

2.2 雙孢蘑菇二級液體種子培養(yǎng)單因素試驗分析

2.2.1 溫度對菌絲球生物量、菌絲球直徑及菌絲球密度的影響

由圖1可知，隨著溫度的升高，菌絲體生物量先增加后下降。25℃時菌絲體生物量最大，超過25℃，菌絲體的生物量逐漸下降。由圖2可以看出，隨著溫度的升高，菌球直徑與菌球密度都是呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢。這是由于在液體培養(yǎng)過程中，隨著溫度的上升，菌體衰老加快［12］，而溫度過低時，又不利于菌絲體生長。

圖1 溫度對生物量的影響Fig.1 Effect of temperature on biomass

圖2 溫度對菌球直徑、菌球密度的影響Fig.2 Effect of temperature on diameter and density

另外，在本試驗供試裝液量和搖床轉(zhuǎn)速條件下，25℃時菌球直徑最大，超過25℃后逐漸下降;22℃時菌球密度達到最大值，隨后逐漸降低。綜合考慮，選用溫度 22、25、28℃。

2.2.2 初始pH值對菌絲球生物量、菌絲球直徑及菌絲球密度的影響

由圖3可知，初始pH值對菌絲球生物量的影響呈現(xiàn)上升后下降趨勢，當初始pH值為6.5時，菌絲體生物量最大，達到135.727 mg/mL。

圖3 pH值對生物量的影響Fig.3 Effect of pH on biomass

由圖4可以看出，菌球直徑隨pH值增大逐漸變大，而菌球密度隨pH值增大逐漸明顯下降。

圖4 pH值對菌球直徑、菌球密度的影響Fig.4 Effect of pH on diameter and density

初始pH為6.0～6.5時，菌球直徑恰當，為1.7～1.8 mm，菌球密度較為適中，為39個/mL。這是由于真菌生長的最適pH一般是中性偏酸，在6.0左右［14］，過高或過低都不利于菌絲體生長。因此做正交試驗時選用pH值為5.5、6.0、6.5。

2.2.3 接種量對菌絲球生物量、菌絲球直徑及菌絲球密度的影響

由圖5可知，當接種量為6% ～12%時，菌絲體生物量隨著接種量的增大而增多;接種量為12%時，生物量達到最大128.6 mg/mL。由圖6可以看出，隨著接種量的增大，菌球直徑先減小后增大，而菌球密度先升高后降低;當接種量大于10%后，菌球直徑變大，菌球密度反而隨接種量的增大而減小。這是由于在固定容積，同一營養(yǎng)水平下，隨著接種量的增大，菌體之間的營養(yǎng)競爭也相應(yīng)地增大，生長周期減短，提前進入衰亡期，以致菌球數(shù)量減少［15］。綜合考慮，選用接種量為8%、10%、12%。

圖5 接種量對生物量的影響Fig.5 Effect of inoculum volume on biomass

2.2.4 裝液量對菌絲球生物量、菌絲球直徑及菌絲球密度的影響

由圖7和圖8可以看出，裝液量為100 mL時菌體生長情況最好，通常裝液量與培養(yǎng)基中的溶氧量成反比，裝液量多則培養(yǎng)基中的溶氧量就會相應(yīng)地減少［10］。隨著裝液量的進一步增加，溶氧量降低導(dǎo)致菌體的生長變得緩慢，菌球密度降低，菌球直徑變大。所以選用裝液量為80 mL、100 mL、120 mL。

圖6 接種量對菌球直徑、菌球密度的影響Fig.6 Effect of inoculum volume on diameter and density

圖7 裝液量對生物量的影響Fig.7 Effect of volume on biomass

圖8 裝液量對菌球直徑、菌球密度的影響Fig.8 Effect of volume on diameter and density

2.3 雙孢蘑菇二級液體種子培養(yǎng)條件正交試驗分析

基于2.2單因素所得的最佳條件，采用正交表L9(34)安排正交試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Analysis of orthogonal experiment for culture conditions optimization

續(xù)表3

為檢驗各因素對菌絲球生物量的影響程度，首先做生物量方差分析，結(jié)果見表4。

表4 菌絲球生物量方差分析Table 4 Analysis of variance on biomass

通過表4方差分析，結(jié)果表明，在0.05的顯著水平下，裝液量對雙孢蘑菇菌絲體生物量的影響不顯著，而溫度、初始pH及接種量對菌絲體生物量均有顯著影響。

表5 菌絲球生物量極差分析Table 5 Analysis of range on biomass

由表5極差分析結(jié)果可知:在試驗取值范圍內(nèi)，影響因素中對生物量影響最大的是溫度(R=48.9)，其次是初始pH(R=37.4)，再次是接種量(R=34)，而對生物量影響最小的是裝液量(R=6.9)。從極差分析表中可以得出每個因素的最佳水平，將其組合在一起即為最優(yōu)組合:培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6.0、接種量12%、裝液量100 mL。

由于在表3正交試驗中得出的菌絲體最高生物量的繁育條件為:培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6.0、接種量12%、裝液量80 mL，生物量達到242.1 mg/mL;而在極差分析結(jié)果中得出的最優(yōu)組合為培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6.0、接種量12%、裝液量100 mL，二者不一致，故需通過驗證實驗進行比較，即在培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6.0、接種量12%、裝液量100 mL的條件下開展菌絲體液體繁育試驗，測定菌絲體生物量、菌球直徑及菌球密度，重復(fù)測定6次，結(jié)果見表6。

表6 最優(yōu)組合下雙孢蘑菇菌株的生物量、菌球直徑及密度Table 6 Biomass，hypha global diameter and density of Agaricus bisporus under the optimal combination

在最優(yōu)組合即培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6.0、接種量12%、裝液量100 mL的條件下，菌絲體生物量濕重平均值為249.6 mg/mL，折算成干重為25.0 mg/mL，菌球直徑平均值為1.83 mm，菌球密度的平均值為65個/mL，高于在正交表3中得出的最高菌絲體生物量。

優(yōu)化得到的繁育條件為:培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6.0、接種量12%、裝液量100 mL。菌球直徑為1.5～2.0 mm，菌球密度為50～80個/mL，符合雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)中可進行自動化噴灑播種的液體菌種要求。

2.4 雙孢蘑菇二級液體種子最適培養(yǎng)周期試驗分析

二級液體種子最適培養(yǎng)周期試驗結(jié)果見圖9。在雙孢蘑菇液體菌種培養(yǎng)過程中，菌絲球生物量的變化符合微生物生長曲線，在第216 h達到最大值260.07 mg/mL，隨后菌絲球的生物量保持相對穩(wěn)定并開始逐步下降。這可能是由于菌絲體生長進入衰亡期而發(fā)生菌絲球自溶。

圖9 搖瓶發(fā)酵過程中各理化指標的動態(tài)變化Fig.9 The dynamic variation of physical and chemical index in the submerged fermentation

液體培養(yǎng)過程中pH值的變化不大，但還是呈先下降后上升的趨勢。pH值前期降低，是因為菌絲體在大量生長增殖過程中，消耗了碳源產(chǎn)酸所致，發(fā)酵終點期pH值上升，是因為菌絲體自溶，胞內(nèi)蛋白外流造成。還原糖含量變化先升高后降低，在第168 h達到最大值10.7 mg/100 mL，隨著發(fā)酵液中基質(zhì)的大量消耗，使得還原糖的含量逐漸下降，在第216 h還原糖含量達到一個最低值為5.4 mg/100 mL，但仍高于發(fā)酵液內(nèi)還原糖原始含量3.2 mg/100 mL，這充分說明菌絲體在生長過程中能夠水解淀粉成為還原糖。216 h后，菌絲體開始進入穩(wěn)定期和衰亡期，生長、增殖速度開始減慢，使得已水解的淀粉被利用的速度逐漸降低，還原糖的含量又有一個較弱的上升趨勢。氨基氮含量在培養(yǎng)過程中呈波浪形變化，但在第72 h有一個明顯的上升，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，其含量呈下降趨勢。這也說明在液體菌種培養(yǎng)過程中菌絲體對氮源的利用是隨著生物量的變化而變化的，與生物量呈負相關(guān)的關(guān)系?？蛇x擇第216 h為液體菌種培養(yǎng)終點，此時的菌絲球生物量及活性最高。

3 結(jié)論與討論

有關(guān)食用菌液體菌種的研究及應(yīng)用在國內(nèi)外已有很多報道，大多數(shù)的研究都是基于通過對培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高食用菌菌絲體生物量。Marry等通過對雙孢蘑菇菌絲體進行均質(zhì)液體培養(yǎng)，探討了均質(zhì)液體培養(yǎng)對雙孢蘑菇菌絲體生長狀況的影響［7］。Kurbanoglu采用公羊角水解液作為營養(yǎng)基質(zhì)對雙孢蘑菇ATTC 10893菌株的菌絲體進行了深層液體培養(yǎng)，獲得的菌絲體生物量干重達到10.8 mg/mL［17］。如羅幃通過對雙孢蘑菇2796菌株液體菌種的工藝研究，其菌絲體生物量干重達到25.4 mg/mL［10］;馬忠友通過優(yōu)化雙孢蘑菇液體菌種培養(yǎng)基配方，篩選到在黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，KH2PO40.05%，MgSO40.2%，麥麩0.2%組成的最優(yōu)培養(yǎng)基配方下，菌絲體生物量干重達到6.45 mg/mL［18］。

本試驗篩選出了以馬鈴薯為主要基質(zhì)的一級液體種子培養(yǎng)基，結(jié)合玉米淀粉作為二級液體種子培養(yǎng)基，在優(yōu)選培養(yǎng)條件下，不僅在菌絲體生物量上達到25.0 mg/mL，而且使菌球直徑和菌球密度得到有效的控制，以便應(yīng)用于液體菌種的工業(yè)化生產(chǎn)與工廠化栽培中的自動化播種。獲得了如下結(jié)論:

(1)本試驗通過對4種供試液體培養(yǎng)基的篩選，確定出了雙孢蘑菇As2796一級液體種子的最佳培養(yǎng)基為:馬鈴薯80 g、紅糖 12 g、葡萄糖 9 g、蛋白胨 2 g、酵母膏 1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、VB10.01 g、水 1 000 mL。

(2)運用單因素和正交試驗組合優(yōu)化的適合于雙孢蘑菇工廠化噴灑播種的二級液體菌種繁育條件為:揺瓶轉(zhuǎn)速 150 r/min、培養(yǎng)溫度 25℃、初始 pH 6.0、接種量12%、裝液量100 mL。在此條件下雙孢蘑菇菌絲體生物量干重可達到25.0 mg/mL，菌絲球直徑在1.5～2.0 mm，菌絲球密度為50～80個/mL。

(3)通過對最優(yōu)條件下雙孢蘑菇二級液體種子培養(yǎng)過程中的各理化指標進行動態(tài)跟蹤測定，確定216 h為二級液體種子最適培養(yǎng)周期。

綜上所述，本試驗通過雙孢蘑菇As2796菌株一級液體種子培養(yǎng)基篩選，以及二級液體種子繁育條件的優(yōu)化，對雙孢蘑菇工業(yè)化生產(chǎn)中液體菌種的生產(chǎn)條件進行了探索，為蘑菇工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

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