黃酒中生物胺的形成及其影響因素*

張鳳杰，薛潔，王異靜，王德良，周建弟，謝廣發(fā)

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)2(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興，31200)

黃酒是以谷物為原料，由多種微生物(霉菌、酵母和細(xì)菌)共同參與釀制而成的一種低酒精度發(fā)酵酒，是中華民族的國粹之一。作為中國特有的傳統(tǒng)酒種，其獨(dú)特的開放式多菌種發(fā)酵技術(shù)，完全不同于葡萄酒等采用單一菌株發(fā)酵的飲料酒，多菌種發(fā)酵雖然造就了黃酒酒體風(fēng)味醇厚、豐滿、完整和馥香的特點(diǎn)，但發(fā)酵過程復(fù)雜且難以控制，易產(chǎn)生一些潛在的有害物質(zhì)，生物胺就是其中之一［1－5］。

生物胺是一類堿性含氮化合物，因其潛在的毒性作用和對生產(chǎn)衛(wèi)生條件的指示作用而受到消費(fèi)者、制造商和研究者的關(guān)注。食用含高濃度生物胺的食品后，會引起一系列不良反應(yīng)，如頭痛。其中組胺的毒性最大，其次是酪胺?？诜?～40 mg組胺會產(chǎn)生輕微中毒癥狀，超過40 mg會產(chǎn)生中等中毒癥狀，超過100 mg會產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀;酪胺的最大攝入量為100～800 mg/kg，超過1 080 mg/kg會引起嚴(yán)重中毒。哺乳動物的腸道和消化道具有一定的解毒功能，在酶的作用下單胺或多胺的氨基被氧化，從而達(dá)到解毒的作用，但酒精和乙醛抑制這些酶的活性［6－10］。

目前，對黃酒生物胺的研究多集中于檢測分析方面，對黃酒釀造過程中生物胺的產(chǎn)生和影響因素分析報道較少。根據(jù)資料報道，我國葡萄酒中生物胺含量在6.34～39.05 mg/L之間，啤酒中生物胺含量范圍為2.20 ～42.03 mg/L［11］，而黃酒中生物胺的平均含量卻達(dá)到115 mg/L［1］，因此，黃酒中生物胺含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葡萄酒和啤酒。作為中國民族特色產(chǎn)品，我國黃酒產(chǎn)品國際市場占有率極低，因此如何提高黃酒質(zhì)量安全水平，加強(qiáng)黃酒安全監(jiān)控，是提高我國黃酒產(chǎn)品國際競爭力的關(guān)鍵之一。本研究通過分析原料、菌種、發(fā)酵工藝及貯存時間對黃酒中生物胺含量的影響，探究黃酒生物胺含量的變化規(guī)律，為進(jìn)一步控制黃酒中生物胺含量提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

糯米、麥曲、酒母、發(fā)酵醪、黃酒樣品，由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(Agilent1100，Perkin Elmer Series 200，配紫外檢測器);離心機(jī);旋渦混合器;恒溫箱;氮吹儀;超聲波清洗器;分析天平(精確至0.000 1 g);pH計(jì);超純水器;0.45 μm針頭微孔濾膜過濾器。

1.1.3 主要化學(xué)試劑

8種單體生物胺標(biāo)樣(色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺)，18 種氨基酸標(biāo)樣，1，7二氨基庚烷(內(nèi)標(biāo))，丹磺酰氯(衍生劑)，均為Sigma公司產(chǎn)品;異硫氰酸苯酯，三乙胺，三氯甲烷，正丁醇，正己烷，三氯乙酸，丙酮，甲醇，乙腈，均為色譜純。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理和生物胺測定方法：

參照GB/T 5009.208－2008食品中生物胺含量的測定［12］。

1.2.2 氨基酸的測定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色譜法［13］。

1.2.3 酒精度、總酸、的測定

參照GB/T13662－2008黃酒國家標(biāo)準(zhǔn)［14］。

1.2.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法

采用細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)法，將黃酒發(fā)酵液梯度稀釋至 10－5，10－6，10－7，分別接種于改良 MRS 固體培養(yǎng)基上［15］，30℃厭氧培養(yǎng)2 d后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 感官品評

1.3.1 品評人員

國家級或省級黃酒評委。

1.3.2 品評依據(jù)

根據(jù)理化指標(biāo)初步確定候選的批次和缸別，取上清液，分別裝在三角瓶中，在電爐上加熱至剛沸騰并有大氣泡，移去熱源，稍冷后倒入各組(6個)酒杯中;通過品評人員對其澄清度和感官品質(zhì)進(jìn)行評價來劃分質(zhì)量。即澄清度好則發(fā)酵成熟，渾濁或產(chǎn)生沉淀則發(fā)酵尚不成熟;口味以暴辣、爽口、無異味為佳［16］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Origin8.5作圖和SPSS10.0進(jìn)行相關(guān)性分析和單因素方差分析，P＜0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 原料和糖化發(fā)酵劑中生物胺含量及影響分析

紹興黃酒釀造是以糯米為原料，以塊曲和熟曲為糖化劑，以速釀酒母(機(jī)械化新工藝黃酒)或淋飯酒母(傳統(tǒng)工藝黃酒)為發(fā)酵劑。本研究選取黃酒釀造用水、3種不同產(chǎn)區(qū)的粳糯米、3種不同產(chǎn)區(qū)的秈糯米、3種麥曲、7種淋飯酒母和1種速釀酒母共18個樣品，檢測其生物胺含量，結(jié)果如表1、表2所示。

表1 黃酒釀造原料中生物胺含量mg/LTable 1 Content of biogenic amines in glutinous rices mg/L

從表1結(jié)果可以看出:水中不含生物胺;糯米中僅檢出腐胺、尸胺和精胺3種脂肪族生物胺，它們的產(chǎn)生與衛(wèi)生條件密切相關(guān)［17］。生物胺總量范圍為0.14～6.01 mg/kg，其中腐胺含量比和檢出率最大，尸胺僅在粳糯米3中檢出。3種粳糯米中生物胺含量差異顯著(P＜0.05)，3種秈糯米無顯著差異。

從表2結(jié)果可以看出:曲中檢出少量生物胺，總含量不超過1.00 mg/kg，其中腐胺含量比和檢出率最大;酒母中除組胺和酪胺在少量樣品中未檢出外，8種胺均被檢出，且不同酒母生物胺含量差異顯著(P＜0.05)，變化范圍為16.43～87.72 mg/L。腐胺是酒母中的主要生物胺，含量占19.83～68.23%，差異極顯著(P＜0.01)。色胺在淋飯酒母中的平均含量為12.16 mg/L，酪胺僅為3.72 mg/L。

表2 黃酒釀造不同曲和酒母中生物胺含量mg/LTable 2 Content of biogenic amines in“wheat Qu”and seed starters mg/L

續(xù)表2

按照黃酒機(jī)械化生產(chǎn)的原料配比和表2中總量平均值計(jì)算，糯米、曲、酒母帶入黃酒的生物胺約為1.22 mg/L、0.11 mg/L、6.03 mg/L，因此，酒母帶入前酵罐的生物胺總量最大，其次是糯米，曲帶入的極少。

酒母的優(yōu)劣是決定黃酒釀造中發(fā)酵好壞的關(guān)鍵，也與黃酒風(fēng)味有著重要的關(guān)系。成熟的淋飯酒母需經(jīng)過挑選后才能使用，通常采用化學(xué)分析和感官鑒定相結(jié)合的方法進(jìn)行挑選:發(fā)酵正常、酒精度15%以上、總酸6.1g/L以下、爽口無異味的淋飯酒母為優(yōu)良酒母。同樣，酒精度9.0%以上、總酸4.1g/L以下的速釀酒母為成熟酒母［16］。8種不同酒母的化學(xué)分析和感官鑒定結(jié)果見表3，7種淋飯酒母中生物胺總量與總酸、酒精度和感官品評的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。

表3 不同酒母的化學(xué)分析和感官鑒定Table 3 The chemical analysis and sensory analysis of seed starters

表4 淋飯酒母中生物胺總量與總酸、酒精度和感官品評的相關(guān)性分析Table 4 The correlation analysis between content of biogenic amines and total acid，alcohol，sensory analysis

結(jié)果表明，生物胺總量與總酸含量呈正顯著相關(guān)，與酒精度和感官品質(zhì)呈負(fù)顯著相關(guān)，其中與總酸和酒精度的相關(guān)性極顯著，這說明總酸較低、酒精度偏高、感官品評好的淋飯酒母中生物胺含量較少。所以，挑選良好的淋飯酒母不僅能夠保證生產(chǎn)的順利進(jìn)行，而且也是控制發(fā)酵前生物胺含量的關(guān)鍵措施之一。

2.2 黃酒發(fā)酵過程中生物胺含量變化及因素分析

傳統(tǒng)的黃酒釀造工藝是以陶制的大缸和陶壇為發(fā)酵容器，攤飯操作、手工開耙，全開放式發(fā)酵。前酵在大缸中進(jìn)行，發(fā)酵到約第4天將發(fā)酵醪分裝到陶壇中，進(jìn)行緩慢的后發(fā)酵，發(fā)酵期長達(dá)70～80 d。機(jī)械化的黃酒釀造工藝用發(fā)酵罐代替了陶缸和陶壇，機(jī)械設(shè)備代替了手工操作，控溫發(fā)酵，發(fā)酵時間縮短到20 d左右。本研究分別跟蹤兩種工藝發(fā)酵過程中生物胺含量的變化，結(jié)果見圖1所示。

圖1 傳統(tǒng)和機(jī)械化工藝發(fā)酵過程生物胺總量變化曲線Fig.1 Change of biogenic amines content duiring two kinds of different fermentation processes

圖1顯示，2種不同工藝釀造過程中生物胺總量均呈先上升后下降的趨勢。機(jī)械化工藝在第6天達(dá)到最高值，總量的增加表現(xiàn)為前急后緩，發(fā)酵結(jié)束后生物胺總量是發(fā)酵前的286.21%。傳統(tǒng)工藝發(fā)酵過程，發(fā)酵第2天生物胺總量已經(jīng)很高，到15 d時達(dá)到最大值，此值比機(jī)械化工藝最大值高27.8 mg/L，之后呈降低趨勢，發(fā)酵結(jié)束后生物胺含量為110.07 mg/L，與機(jī)械化工藝發(fā)酵結(jié)束時生物胺含量(104.18 mg/L)大致相同。另外本研究分析結(jié)果表明，腐胺是黃酒中的主要生物胺，占生物胺總量20.46% ～54.43%(機(jī)械化工藝)，31.74% ～50.13%(傳統(tǒng)工藝);酪胺是另一個主要生物胺，機(jī)械化黃酒中最高含量為(50.70±2.32)mg/L，傳統(tǒng)工藝為65.66±2.01 mg/L，其他生物胺在2種不同工藝黃酒中也存在差異，如色胺的差異很大，在傳統(tǒng)工藝黃酒中相對較高，最高含量為(37.68±2.04)mg/L，而在機(jī)械化工藝中僅為(10.81±1.75)mg/L，可能與傳統(tǒng)工藝中更為復(fù)雜的微生物群落有關(guān)。

生物胺是由相應(yīng)前體物氨基酸在脫縮酶作用下經(jīng)過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來［18］，因此前體物濃度影響生物胺的含量，本研究跟蹤了黃酒發(fā)酵過程中生物胺和氨基酸變化，如圖2所示。

黃酒發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化是一個動態(tài)過程:一方面，蛋白酶不斷水解蛋白質(zhì)成氨基酸，并且在發(fā)酵后期，酵母等微生物自溶后內(nèi)容物析出，氨基酸含量增加;另一方面酵母生長發(fā)酵，消耗部分氨基酸，但從圖2結(jié)果可知，在發(fā)酵過程中黃酒中氨基酸含量呈顯著的上升趨勢，而酪胺等生物胺均呈現(xiàn)先增多后降低，這從一定程度上說明黃酒中氨基酸含量多少不是限制生物胺合成的條件;對前6天酪胺和酪氨酸變化情況進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.974*，P=0.005，這僅能說明發(fā)酵前6 d兩者成線性正相關(guān);而從氨基酸總量和生物胺總量來看，并無相關(guān)性。因此，可以判斷黃酒發(fā)酵過程中氨基酸含量豐富，不影響生物胺的生成，這與張輝［19］的研究結(jié)論相一致。

圖2 酪胺與酪氨酸，生物胺總量與氨基酸總量變化曲線(氨基酸總量以10 mg/L為單位計(jì)算)Fig.2 Change of tyramine and tyrosine content(a)，change of biogenic amines and amino acids content(b)

乳酸菌是發(fā)酵過程中影響生物胺含量的另一個關(guān)鍵因素［18，20］，黃酒發(fā)酵醪中乳酸菌主要是來自酒母和麥曲，少部分從器具和環(huán)境中接入［16］。由于乳酸菌是黃酒釀造中的主要細(xì)菌［19，21］，本研究分析了機(jī)械化黃酒發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量的變化情況，如圖3所示。

圖3 機(jī)械化工藝發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)目變化曲線Fig.3 Changes of bacterial count in mechanized fermentation process

結(jié)果顯示，發(fā)酵前2 d細(xì)菌數(shù)量急劇增多;但隨著酒精度、總酸的升高，溫度的降低和酵母菌的相互抑制作用等，細(xì)菌數(shù)目大幅減少，至第6天降到0.13×107個，之后幾乎保持穩(wěn)定。這一變化趨勢與機(jī)械化黃酒發(fā)酵過程中生物胺變化趨勢相吻合，這也說明了降低黃酒中產(chǎn)生物胺微生物數(shù)量是控制生物胺含量的關(guān)鍵［22］。

生物胺的降低與生物胺被微生物還原利用及其他化學(xué)還原有關(guān)。微生物體內(nèi)廣泛存在單胺和多胺氧化酶，該酶介導(dǎo)生物胺氧化生成醛，其活性受酸和氧氣的抑制［23－25］。黃酒前酵過程中間隔開耙，使其溶氧增多，抑制了該酶的作用，但后酵過程不管是在陶壇還是在大罐中，都不再開耙，隨著微生物的代謝，發(fā)酵醪中的溶氧越來越少，抑制作用減弱，這就可以解釋黃酒發(fā)酵過程中生物胺的不規(guī)則降低。另外，研究者從紹興黃酒等酒精性飲料中檢測到4-methylspinaceamine，該物質(zhì)是乙醛與組胺的縮合反應(yīng)產(chǎn)物［26］;研究還發(fā)現(xiàn)Lactobacillus sp.(30a和w53)含有利用組胺的操縱子［27］。

2.3 陳釀時間對黃酒中生物胺含量的影響

測定A、B、C 3個廠的部分年份酒生物胺含量(A、B廠為傳統(tǒng)工藝年份酒，C廠為機(jī)械化工藝年份酒)，結(jié)果見圖4。

圖4 A、B、C 3個廠家年份酒生物胺含量Fig.4 The content of biogenic amines in aging wines from three factories

從圖4中生物胺總量變化來看，傳統(tǒng)工藝釀制黃酒越陳，生物胺含量越低，而機(jī)械化年份酒沒有規(guī)律性變化，這說明在生物胺危害性方面，傳統(tǒng)工藝發(fā)酵黃酒的陳釀價值要優(yōu)于機(jī)械化黃酒;以3個廠第3年的年份酒來看，機(jī)械化工藝的生物胺總量較傳統(tǒng)工藝低;腐胺、酪胺依舊是黃酒中的主要生物胺，不因廠家和年份而改變，3個廠的平均比例依次是:83.94%，79.04%，68.03%。但樣品并非同一批樣品，初始值本身存在差異。

3 小結(jié)與討論

本文分析了黃酒釀造過程中生物胺、氨基酸和乳酸菌的動態(tài)變化，研究表明:

(1)糯米原料和曲對黃酒生物胺影響很小，僅檢出腐胺、尸胺和精胺，但總量不超過6.01 mg/L。酒母對黃酒生物胺的影響較大，酒母中生物胺總量與總酸、酒精度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與感官品質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

(2)黃酒釀造過程中含量最多的生物胺是腐胺，其次是酪胺;組胺的檢出率很高，但含量極少超過10.00 mg/L;色胺在傳統(tǒng)工藝過程中所占比例較機(jī)械化工藝高。

(3)發(fā)酵過程對黃酒生物胺的影響最大，傳統(tǒng)和機(jī)械化兩種工藝差異明顯，前者較后者生物胺含量高，這可能與其復(fù)雜的微生物菌落有關(guān)。長時間后酵和陳釀會降低生物胺含量，縮小兩者的差距。

(4)作為生物胺前體物質(zhì)的游離氨基酸隨發(fā)酵時間含量逐漸增多，豐富的氨基酸不是限制發(fā)酵過程中生物胺形成的因素。生物胺先增多后降低且“前急后緩”的趨勢說明:產(chǎn)生物胺的復(fù)雜菌群隨基質(zhì)條件的變化而相應(yīng)變化是生物胺形成的關(guān)鍵。

基于上述結(jié)果，本文提出以下控制生物胺形成或降低生物胺含量的措施:

(1)生產(chǎn)上選用總酸較低、酒精度偏高、感官品評好的淋飯酒母可有效降低黃酒中生物胺含量。在實(shí)際生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，適當(dāng)延長后酵和陳釀時間也可以降低生物胺含量。

(2)由于黃酒發(fā)酵醪中乳酸菌產(chǎn)生物胺的能力存在差異，所以在生產(chǎn)上控制產(chǎn)生物胺能力強(qiáng)的菌株，或接種不產(chǎn)(低產(chǎn))生物胺的菌株來完成發(fā)酵，是從根本上控制生物胺形成的有效方法之一。

(3)研究證明微生物體內(nèi)廣泛存在單胺和多胺氧化酶，組胺和酪胺氧化酶的作用阻止了食品中的組胺和酪胺的積聚。因此，在生產(chǎn)上添加氧化酶或者利用特殊菌群間的相互作用可能會降低生物胺的含量。

(4)黃酒本身是一個成分復(fù)雜的不穩(wěn)定膠體，不同酒樣有自己穩(wěn)定的pH值和等電點(diǎn)，打破膠體的平衡，某些成分會析出以達(dá)到新的平衡。是否可以利用此手段來降低黃酒中生物胺含量還需要進(jìn)一步研究。

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