尿素-SDS-PAGE測(cè)定小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量方法的建立

王麗榮，程福亮，陳 雷，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

蛋白質(zhì)的生化分析和基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化中，難免會(huì)需要分離某種或某些小分子蛋白質(zhì)成分。近年來(lái)，用電泳法測(cè)定小分子多肽分子量的研究報(bào)道較少。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）方法用作蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定的技術(shù)最早由Shapiro等于20世紀(jì)60年代建立，隨后Weber等進(jìn)行了改進(jìn)，顯示出了該方法在分離鑒定和純化蛋白質(zhì)方面的優(yōu)越性。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和基因工程藥物的大量涌現(xiàn)，具有高生物活性小分子多肽的分離、純化和鑒定已顯得尤為突出，而小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，目前多采用Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)，但系統(tǒng)中的Tricine價(jià)格昂貴，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，且由于小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量小，易受電泳緩沖系統(tǒng)、凝膠濃度、電泳時(shí)間、染色和脫色等的影響，極易引起條帶擴(kuò)散、不易著色，使分辨率降低，因而直接影響多肽相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定[1-2]?，F(xiàn)有多肽相對(duì)分子質(zhì)量的3層膠電泳測(cè)定方法操作復(fù)雜。張曉楠等采用尿素SDS-PAGE法快速測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量為2 500～17 000的多肽[3]。石繼紅等也分別對(duì)小分子肽類進(jìn)行測(cè)定[4]。

轉(zhuǎn)移因子（TF）屬于淋巴因子，可特異或非特異性地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)、增強(qiáng)其細(xì)胞免疫和骨髓造血功能，已在臨床應(yīng)用多年，在原發(fā)性免疫缺陷病或慢性病毒感染疾病中作為免疫治療藥物作用，目前已得到肯定，特別是對(duì)病毒性上呼吸道感染治療取得良好效果[5]。主要成分為小分子多肽和核苷酸，為免疫調(diào)節(jié)劑。本研究根據(jù)小分子多肽條帶分辨率高、操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間少、低成本等原則，改進(jìn)低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白——轉(zhuǎn)移因子的尿素-SDS-PAGE方法，并為小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

垂直電泳儀及其配件、Power PAC200穩(wěn)壓穩(wěn)流電源由Bio-Rad公司生產(chǎn)；GDS28000凝膠圖像處理系統(tǒng)由英國(guó)UVP公司生產(chǎn)。低分子量蛋白Marker購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；小分子多肽樣品由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存。

1.2 試劑及配制

30%丙烯酰胺：稱取丙烯酰胺29 g和N,N'-亞甲雙丙烯酰胺1 g溶于超純水80mL中，定容至100 mL。0.45μm濾膜過(guò)濾后，測(cè)定pH。10%SDS：稱取SDS 10 g溶于超純水80mL中，定容至100 mL。1.5 mol·L-1Tris-CL：稱取 Tris-Base 18.171 g溶于超純水80mL中，用濃鹽酸調(diào)整pH至8.8，定容至 100 mL。0.5 mol·L-1Tris-CL：稱取Tris-Base 6.057 g溶于超純水80mL中，用濃鹽酸調(diào)整pH至6.8，定容至100mL。10%APS：稱取過(guò)硫酸銨2.282 g溶于超純水8 mL中，定容至10mL。Running Buffer：稱取 Tris-Base 3.03 g， Glycine 18.8 g， SDS 5 g溶解，定容至1 000mL。1×SDS上樣緩沖液： 0.05mol·L-1Tris-HCL，100mM β-巰基乙醇，2%（m/V）SDS，0.1%（m/V）溴酚藍(lán)，10%（V/V）甘油。染色液：0.1%（m/V）考馬斯亮藍(lán)R-250，25%（V/V）甘油，10%（V/V）冰醋酸。脫色液：10%（V/V）醋酸，5%（V/V）乙醇量取醋酸100mL、乙醇50mL溶于超純水800mL中，定容至1 000mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備及樣品處理

用自來(lái)水清洗燒杯、電泳儀及其配件，蒸餾水沖洗干凈，晾干備用，玻璃板先用自來(lái)水清洗，擦干，酒精棉球擦干，自然晾干備用。

1.3.2 配膠

15%分離膠和5%濃縮膠的配制方法見表1。

表1 尿素-SDS-PAGE法制膠配方

5%分離膠：在燒杯中依次加入超純水2.3mL、30%丙烯酰胺5 mL、1.5 mol·L-1Tris-CL 2.5 mL、10%SDS 0.1 mL、10%APS 0.1 mL、TEMED 0.004 mL，加入TEMED混合均勻后，立即用吸管加入膠板中（倒膠時(shí)，以梳子齒端為參照，預(yù)留1 cm濃縮膠空間），膠上加滿蒸餾水封閉，以防蒸發(fā)，分離膠室溫約30min即可完全凝固。5%濃縮膠：燒杯中依次加入合適量的超純水2.1mL、30%丙烯酰胺0.5 mL、0.5 mol·L-1Tris-CL 0.38 mL、10%SDS 0.03 mL、10%APS 0.03mL，先將分離膠上的超純水倒掉，并用濾紙小心吸干殘留水分，再將TEMED 0.003mL加入燒杯中，混合均勻立即用移液槍滴加到分離膠上，插入合適的梳子，積層膠約20min可完全凝固。

1.3.3 加樣

小心拔掉梳子，組裝好電泳儀。然后倒入1×Running Buffer。將蛋白Marker和處理好的樣品按順序加入膠孔，并做好記錄。

1.3.4 跑膠

加樣完畢即可跑膠，可固定電壓進(jìn)行跑膠。Bio-Rad電泳儀可固定在200V，君意電泳儀固定在150V，當(dāng)染帶剛剛跑出膠板時(shí)，跑膠完成。

1.3.5 卸膠

小心拆卸膠板，用分離器小心將兩層玻璃板分離，切去積層膠。

1.3.6 染色

將分離膠放于染色盒中，倒入染色液20mL，放在搖床上慢慢搖動(dòng)。染色20min即可。

1.3.7 脫色

將分離膠取出，放于脫色盒，倒入脫色液30 mL，放在搖床上慢慢搖動(dòng)過(guò)夜，或隨時(shí)觀察，直至分離膠除有蛋白的地方為藍(lán)色其余部分變?yōu)闊o(wú)色即可。

1.3.8 小分子多肽樣品中蛋白遷移率的測(cè)定及其相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算

用倍率計(jì)讀出照片上各樣品色帶中心與溴酚藍(lán)前沿的距離，按標(biāo)記變化比率換算出實(shí)際尺寸進(jìn)行計(jì)算。電泳遷移率為Rf，即樣品遷移距離與溴酚藍(lán)遷移距離的比值。以標(biāo)準(zhǔn)組多肽的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)未知樣品的遷移率在曲線上查出其對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小分子多肽樣品的尿素-SDS-PAGE結(jié)果

小分子多肽樣品的尿素-SDS-PAGE結(jié)果見圖1。

圖1 小分子多肽的尿素-SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果

由圖1可知，小分子蛋白樣品中蛋白濃度較高，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量＜14.4 kD，樣品純度較高，無(wú)其他蛋白雜帶，陰性對(duì)照無(wú)特定條帶。

2.2 不同稀釋濃度小分子多肽樣品的尿素-SDSPAGE結(jié)果

不同稀釋濃度小分子多肽樣品的尿素-SDSPAGE結(jié)果見圖2。

圖2 小分子多肽樣品不同稀釋濃度的尿素-SDS-PAGE結(jié)果

通過(guò)10倍稀釋小分子多肽樣品，進(jìn)行尿素-SDS-PAGE電泳，圖2顯示獲得了較好的結(jié)果，A1～A5小分子蛋白樣品濃度逐漸降低，呈現(xiàn)較好的規(guī)律變化。

2.3 尿素-SDS-PAGE中蛋白條帶遷移率及分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

尿素-SDS-PAGE中蛋白條帶遷移率及相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制見表2。

表2 尿素-SDS-PAGE中蛋白條帶遷移率的測(cè)定

由表2中的數(shù)據(jù)繪制完成可進(jìn)行測(cè)定小分子蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，其中相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來(lái)測(cè)定小分子多肽的相對(duì)分子質(zhì)量。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 小分子多肽樣品中蛋白遷移率的測(cè)定及其相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算

測(cè)定尿素-SDS-PAGE電泳中小分子多肽樣品的遷移率為23.5，將此數(shù)值帶入到相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到待測(cè)小分子多肽樣品的相對(duì)分子質(zhì)量為9.212 977 277 kD。

3 討論

隨著生物活性多肽物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和多肽類藥物的研制，小分子多肽電泳已成為生物活性物質(zhì)純化分析過(guò)程中經(jīng)常使用的快速鑒定方法。凝膠電泳操作簡(jiǎn)單、分辨率高，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定通常采用非連續(xù)的SDS-PAGE緩沖系統(tǒng)，緩沖液采用Tris-HCl；而多肽相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定采用Tris-Tricine緩沖液，可使小相對(duì)分子質(zhì)量多肽在濃縮膠中有效地濃縮，從而提高分辨率。SDSPAGE的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，其孔徑隨著雙丙烯酰胺與丙烯酰胺比值的增加而減小，相對(duì)分子質(zhì)量＜10 000的小分子肽，即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠的SDSPAGE也不能完全分離。本研究建立的雙層膠尿素-SDS-PAGE測(cè)定小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量的方法操作簡(jiǎn)便，將常規(guī)的3層膠改為2層膠（分離膠和濃縮膠），濃縮膠與分離膠采用同一緩沖體系，簡(jiǎn)化操作步驟，減少由于凝膠制備而引起的諸多影響電泳的因素；分辨率高，將3層膠改為2層膠后，分離膠的有效長(zhǎng)度增加，可使單位凝膠長(zhǎng)度下容納的電泳條帶數(shù)增加，從而使分辨率提高；成本低，替代了昂貴的Tris-Tricine緩沖系統(tǒng)，電極緩沖液可以重復(fù)利用；電泳時(shí)間短，由原來(lái)5～6 h縮短為2.5 h，達(dá)到了快速檢測(cè)的目的。

本試驗(yàn)用含6mol·L-1尿素的SDS-PAGE方法，不需銀染而直接用考馬斯亮藍(lán)R2250染色1.5～2 h，即可把標(biāo)準(zhǔn)品中的條帶顯示清楚，且簡(jiǎn)單方便，試驗(yàn)范圍內(nèi)多肽相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)與遷移率呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.993 8。該方法的建立為小分子多肽分子量的估算提供了一種較好方法。

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