H₂O₂對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗抗氧化酶及細(xì)胞活性的影響

葉亞新，陸丹華

摘要：以小麥（Triticum aestivum L.）為試驗(yàn)材料，采用完全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，外加適當(dāng)濃度的過(guò)氧化氫（H2O2），同時(shí)以不加H2O2為對(duì)照，再以不同濃度Pb溶液培養(yǎng)進(jìn)行Pb脅迫，檢測(cè)小麥幼苗過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性及丙二醛（MDA）含量、根系活力及微核率等指標(biāo)的變化，以探究外源H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥抗氧化酶及其細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，Pb脅迫下小麥幼苗的生長(zhǎng)代謝受到一定程度的抑制，主要表現(xiàn)為根系活力下降，POD、SOD、CAT活性增強(qiáng)，MDA含量和微核率上升；經(jīng)適當(dāng)濃度H2O2處理后，Pb脅迫小麥幼苗中POD、SOD、CAT活性及根系活力與對(duì)照相比有不同程度地上升，MDA含量及微核率下降，這表明外加H2O2對(duì)Pb脅迫小麥所受的傷害有一定的緩解作用，可增強(qiáng)小麥幼苗對(duì)重金屬Pb的抗性。

關(guān)鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）；H2O2；Pb脅迫；抗氧化酶；根系活力；微核率

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945.78；S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）05-1007-05

Effect of Hydrogen Peroxide on Antioxidant Enzymes and Cell Activity of Wheat Seedlings under Lead Stress

YE Ya-xin，LU Dan-hua

（School of Chemistry and Bioengineering， Suzhou Science & Technology College， Suzhou 215009，Jiangsu， China）

Abstract： To explore the effect of exogenous H2O2 on antioxidant enzymes and other physiological indexes of wheat seedlings under lead stress， wheat seedlings cultivated in solution with different concentration of H2O2 were used to observe the variation of activity of peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and content of malondialdehyde （MDA）， root activity and micronucleus rate. The results showed that wheat seedlings were chronically harmed under heavy metal stress， as vigor of wheat seedling root decreased； POD， SOD， CAT activity and MDA content， micronucleus rate increased. After being treated by H2O2 with appropriate concentration， POD， SOD， CAT activity， root vigor increased while MDA content and micronucleus rate decreased in wheat seedlings under lead stress compared to control， indicating that exogenous H2O2 could reduce the damage caused by lead stress.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； H2O2； lead stress； antioxidant enzymes； root activity； micronucleus rate

目前，在令人擔(dān)憂(yōu)的環(huán)境問(wèn)題中，Cd、Pb等重金屬污染因?qū)χ脖辉斐蓮?qiáng)烈沖擊以及沿食物鏈的富集作用而倍受關(guān)注。Pb作為一種有毒的重金屬元素進(jìn)入土壤后不能被微生物降解，一旦污染土壤，很難去除。有關(guān)植物受到重金屬脅迫后自身抗氧化酶活性的變化已有一些研究，但主要集中在對(duì)Hg、Cd等重金屬的研究上。關(guān)于植物受到Pb脅迫后對(duì)自身抗氧化酶活性及細(xì)胞活性的影響還少見(jiàn)報(bào)道。植物的生長(zhǎng)發(fā)育受激素和環(huán)境信號(hào)的調(diào)控。過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）是一類(lèi)重要的信號(hào)分子，在生物體內(nèi)積累過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒害作用[1]；但另一方面， 稀H2O2（<10 mg/L）能夠提高水稻幼苗抗氧化酶活性，降低丙二醛（MDA）含量[2]；H2O2還與其他信號(hào)特別是植物激素相互作用，影響一些蛋白激酶與蛋白磷酸酶等一系列下游信號(hào)分子的產(chǎn)生和參與[3]。因此，H2O2可能在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。

為探究H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥（Triticum aestivum L.）幼苗抗氧化酶活性及細(xì)胞活性的影響，以小麥種子為培育對(duì)象，模擬Pb污染，外加H2O2培育后測(cè)定抗氧化酶活性及其他細(xì)胞活性指標(biāo)，旨在考察利用H2O2作為植物抗重金屬脅迫的拮抗劑的可能性，為H2O2在農(nóng)業(yè)上的潛在應(yīng)用提供生理生化依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種為永良4號(hào)，由蘇州市種子公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 小麥幼苗培育方法 小麥種子用水沖洗多次，挑除雜質(zhì)，除去漂浮的種子，用10% H2O2浸泡 10 min，然后用去離子水沖洗4～5次，直至沖洗干凈。淘洗后放入多于種子體積2～3倍的清水中，在室溫下浸種8 h。

浸種后將挑選種子均勻放入底部鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中放少量的去離子水（半浸沒(méi)種子為宜），蓋好培養(yǎng)皿，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽。水培催芽3 d左右，等根長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)撤掉下方的濾紙，以防小麥根長(zhǎng)在濾紙上，然后去除小麥胚乳，分裝到洗凈晾干的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)置于25 ℃的培養(yǎng)箱中加完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)出第二片真葉（二葉期，完全培養(yǎng)液培養(yǎng)4～5 d后）時(shí)進(jìn)行H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗影響的系列處理試驗(yàn)。

1.2.2 H2O2濃度的選擇 為了確定H2O2對(duì)小麥幼苗生理功能的最佳效應(yīng)濃度，設(shè)置了0.000 0（CK）、100.000 0、1.000 0、0.010 0、0.000 1 mmol/L 5種濃度的H2O2梯度溶液，加入小麥幼苗的完全培養(yǎng)液中，對(duì)照組加入等量蒸餾水，恒溫培養(yǎng)5 d后測(cè)定小麥幼苗葉片的質(zhì)膜透性，探究H2O2的劑量效應(yīng)并進(jìn)行H2O2最佳效應(yīng)劑量篩選。

1.2.3 小麥幼苗處理方法 挑選相同長(zhǎng)勢(shì)的小麥幼苗分為兩組，將試驗(yàn)組小麥的完全培養(yǎng)液中加入適量上述試驗(yàn)所選取最適濃度的H2O2進(jìn)行預(yù)處理，CK組的完全培養(yǎng)液中加入等量去離子水，放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后將試驗(yàn)組和對(duì)照組均分為4小組，分別添加到0、10、50和100 mg/L的Pb（NO3）2溶液中，加入完全培養(yǎng)液后置于30 ℃、光照強(qiáng)度33%、光照14 h、黑暗10 h的光照培養(yǎng)箱中培育小麥，試驗(yàn)期間保證幼苗水培營(yíng)養(yǎng)液充足，每天2次添加培養(yǎng)液，必要時(shí)更換完全培養(yǎng)液。5 d后分別測(cè)定兩組小麥幼苗的過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性及MDA含量、根系活性和根尖細(xì)胞微核率。

1.3 測(cè)定方法

POD、SOD、CAT活性及MDA含量、根系活力、葉片質(zhì)膜透性（以相對(duì)電導(dǎo)度反映）的測(cè)定參照文獻(xiàn)[4，5]；根尖細(xì)胞微核率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0進(jìn)行相應(yīng)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2溶液最適濃度的選擇

梅俊學(xué)[7]、肖雯等[8]研究表明質(zhì)膜的通透性可反映質(zhì)膜系統(tǒng)的完整性及其傷害程度，質(zhì)膜透性越大，植物受傷害程度也就越大。由圖1可知，在不同濃度H2O2處理的小麥幼苗中，以0.010 0 mmol/L H2O2作用效果最好，不同濃度H2O2對(duì)小麥幼苗葉片質(zhì)膜透性的效應(yīng)由大到小依次為100.000 0、1.000 0、0.000 1、0.010 0 mmol/L。結(jié)果表明，高濃度的H2O2對(duì)小麥幼苗葉片有較嚴(yán)重的傷害作用，說(shuō)明其在生物體內(nèi)積累過(guò)多時(shí)，會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒害作用。而低濃度的H2O2處理時(shí)小麥幼苗葉片質(zhì)膜透性較小，即低濃度的H2O2溶液在一定程度上能增加小麥膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)小麥幼苗抵抗逆境的能力。因此，后續(xù)H2O2對(duì)Pb脅迫小麥幼苗的影響試驗(yàn)均采用最佳作用效應(yīng)濃度0.010 0 mmol/L。

2.2 H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗葉片POD活性的影響

POD對(duì)各種不良環(huán)境十分敏感，可作為判斷傷害程度和植物抗性大小的指標(biāo)[9]。試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，當(dāng)小麥幼苗遭受到Pb2+脅迫時(shí)，POD活性發(fā)生相應(yīng)變化。隨著Pb（NO3）2脅迫濃度的升高，小麥幼苗POD活性逐漸升高，表明在一定濃度重金屬脅迫下，植物體內(nèi) POD受到活性氧自由基的誘導(dǎo)，活性上升，參與清除自由基，在這一層面上講POD活性的增加既表明了植物已經(jīng)受到了重金屬Pb的脅迫，同時(shí)也是一種保護(hù)機(jī)制。從圖2可以看出，經(jīng)過(guò)H2O2預(yù)處理后的小麥幼苗POD活性比對(duì)照有了一定程度的上升。說(shuō)明H2O2能夠在一定程度上增強(qiáng)小麥葉片的POD活性。

2.3 H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗葉片SOD活性的影響

SOD作為氧自由基的清除劑，其活性高低與植物抗性密切相關(guān)[10，11]。黃玉山等[12]認(rèn)為SOD活性提高是相應(yīng)于活性氧增加的一種急性解毒措施，使細(xì)胞免受毒害的調(diào)節(jié)反應(yīng)。由圖3可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)H2O2預(yù)處理后的小麥幼苗葉片SOD活性與對(duì)照相比均有小幅上升，但在高濃度Pb（NO3）2溶液脅迫下，二者SOD活性均明顯下降。說(shuō)明各個(gè)劑量的Pb（NO3）2溶液對(duì)小麥幼苗已經(jīng)造成傷害時(shí)，H2O2有利于小麥抵抗Pb脅迫所誘導(dǎo)的氧自由基對(duì)自身的傷害。但是當(dāng)脅迫程度過(guò)于嚴(yán)重時(shí)，植物的自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)被破壞，SOD活性下降。本試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[13]。這說(shuō)明以SOD為代表的抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)Pb毒害的保護(hù)作用是有限度的。當(dāng)植物處于相對(duì)較低濃度的重金屬脅迫時(shí)，植物體內(nèi)產(chǎn)生較多氧自由基作為一種機(jī)體應(yīng)激自衛(wèi)反應(yīng)，SOD活性上升可以提高植物清除氧自由基的能力，從而在一定程度上緩解氧自由基積累對(duì)細(xì)胞的破壞。但是，隨著重金屬脅迫濃度的增加至超過(guò)植物所能耐受的極限時(shí)，植物的自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)被破壞，作為防御體系的酶的活性也相應(yīng)減弱。這與低濃度重金屬脅迫促進(jìn)酶活性、高濃度重金屬脅迫抑制酶活性的理論相符。

2.4 H2O2對(duì)鉛脅迫下小麥幼苗葉片CAT活性的影響

當(dāng)外界環(huán)境對(duì)植物產(chǎn)生脅迫時(shí)，CAT作為清除H2O2的主要酶類(lèi)，其活性會(huì)產(chǎn)生變化[14]。試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，隨著Pb（NO3）2濃度的升高，小麥幼苗葉片的CAT活性逐漸升高。經(jīng)過(guò)H2O2預(yù)處理后的小麥幼苗葉片中CAT活性均明顯升高，且在低濃度Pb（NO3）2溶液脅迫時(shí)CAT活性上升幅度較高。

2.5 H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗葉片中MDA含量的影響

MDA作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，用于表示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[15]，其積累還可能對(duì)植物膜和細(xì)胞造成一定的傷害[16]。試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，在Pb（NO3）2溶液處理下，小麥幼苗MDA含量明顯升高，且隨著Pb（NO3）2濃度的增大，MDA含量升高，即高濃度的重金屬對(duì)幼苗的脅迫作用更強(qiáng)。這表明植物處于逆境時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生并積累的大量活性氧會(huì)引發(fā)膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生MDA等有害的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)H2O2預(yù)處理的小麥葉片其MDA含量均比相應(yīng)濃度對(duì)照組低，且低濃度Pb（NO3）2溶液處理的小麥MDA含量下降較明顯，表明適當(dāng)濃度的H2O2在一定程度上能降低植物體內(nèi)MDA含量，減緩Pb2+對(duì)小麥幼苗的傷害；但當(dāng)作用于小麥幼苗的Pb（NO3）2濃度較大時(shí)，H2O2表現(xiàn)出對(duì)重金屬脅迫下小麥幼苗的防護(hù)效應(yīng)減弱。

2.6 H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗細(xì)胞活性的影響

2.6.1 H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗根系活力的影響 根系活力是一種較客觀地反映根系生命活動(dòng)的生理指標(biāo)[17]。植物遭受逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)琥珀酸脫氫酶減少，根系活力下降。由圖6可以看出，小麥幼苗在Pb（NO3）2溶液脅迫下根系活力逐漸下降，其處理濃度越高，幼苗根系受到的傷害越大，根系活力越低。經(jīng)H2O2溶液預(yù)處理后的小麥幼苗根系活力有一定提高，但是在高濃度Pb（NO3）2溶液脅迫下根系活力提高較少。這說(shuō)明H2O2可以一定程度地緩解Pb脅迫對(duì)小麥幼苗根系造成的傷害。但H2O2對(duì)其的緩解能力在高濃度Pb環(huán)境下作用較小。

2.6.2 H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗根尖細(xì)胞微核率的影響 細(xì)胞分裂中染色單體或染色體的無(wú)著絲粒斷片或滯后染色體不包被于主核中，獨(dú)立存在于細(xì)胞質(zhì)中，類(lèi)似細(xì)胞核，但體積較小，稱(chēng)為微核[18]。其形成機(jī)理一般認(rèn)為是生物在環(huán)境中受到輻射或其他誘變因子作用時(shí)，細(xì)胞間期細(xì)胞受到損傷而產(chǎn)生微核。植物幼苗的根尖對(duì)環(huán)境污染物比較敏感，可以利用其微核效應(yīng)監(jiān)測(cè)環(huán)境污染物對(duì)植物的遺傳毒理效應(yīng)。由圖7可以看出，小麥幼苗在Pb（NO3）2脅迫下，根尖細(xì)胞微核率逐漸上升。Pb（NO3）2的處理濃度越高，微核率越高，幼苗根系受到的傷害越大。經(jīng)H2O2溶液預(yù)處理后的小麥幼苗根尖細(xì)胞微核率均有所下降，說(shuō)明H2O2對(duì)Pb脅迫下小麥幼苗根系的遺傳毒性有一定的防護(hù)作用。

3 討論

逆境脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡，造成植物體內(nèi)自由基累積，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生傷害。H2O2是一種重要的信號(hào)分子，能介導(dǎo)植物對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)反應(yīng)。本研究表明，當(dāng)用適當(dāng)濃度的H2O2預(yù)處理小麥幼苗時(shí)，植物抗氧化酶POD、SOD、CAT活性增加，延緩膜脂過(guò)氧化作用的發(fā)生，從而降低了Pb脅迫小麥幼苗葉片中的MDA含量，提高了膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了小麥幼苗抵抗Pb脅迫的作用。

H2O2是活性氧重要的代表之一，激素等信號(hào)或者生物、非生物脅迫刺激均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累。H2O2化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，壽命較長(zhǎng)，具有較高的跨膜通透性并能在植物細(xì)胞間迅速擴(kuò)散，外界刺激能迅速地刺激其合成和分解，這些特點(diǎn)均符合細(xì)胞間信號(hào)分子所具有的重要標(biāo)準(zhǔn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，H2O2在植物面臨環(huán)境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，比如應(yīng)對(duì)逆境產(chǎn)生抗病防御反應(yīng)、調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、參與保衛(wèi)細(xì)胞氣孔運(yùn)動(dòng)等諸多生理過(guò)程。H2O2還與其他信號(hào)分子特別是植物激素相互作用影響一些蛋白激酶與蛋白磷酸酶等一系列下游信號(hào)分子的產(chǎn)生和參與。越來(lái)越多的試驗(yàn)證據(jù)表明，高濃度的H2O2溶液能損傷生物大分子，產(chǎn)生細(xì)胞毒害作用[19]，但低濃度的H2O2溶液作為信號(hào)分子可以擴(kuò)散到細(xì)胞的各個(gè)部位，參與多種生理作用，甚至對(duì)植物的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。

Pb脅迫能夠影響植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，Pb脅迫下，小麥幼苗的根系活力下降，而MDA含量、POD、SOD和CAT活性和微核率均有所上升，這表明重金屬Pb對(duì)植物幼苗存在明顯毒害作用，能夠脅迫其生長(zhǎng)和代謝。而植物可通過(guò)細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)自我調(diào)節(jié)來(lái)抵制逆境脅迫對(duì)機(jī)體的傷害，作為植物的保護(hù)酶系統(tǒng)，POD、SOD、CAT相互協(xié)調(diào)，SOD催化O2-·生成H2O2和O2；CAT則具有分解H2O2的作用，與SOD協(xié)同作用，可以最大限度地減少·OH的形成；POD則能清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物[20]，可以在一定程度上減輕活性氧對(duì)植物細(xì)胞的傷害。而MDA含量和微核率上升、根系活力下降可表明小麥幼苗受Pb2+脅迫傷害的程度。經(jīng)0.010 0 mmol/L H2O2預(yù)處理后的小麥幼苗POD、SOD、CAT活性均有不同程度地上升，而MDA含量下降，說(shuō)明外加H2O2溶液降低了小麥幼苗葉片的膜脂過(guò)氧化程度，減緩了Pb2+對(duì)小麥幼苗的傷害。這表明適量的H2O2能夠增強(qiáng)小麥幼苗抗氧化酶的活性，能夠更快速地清除活性氧自由基，減少積累，降低膜脂過(guò)氧化程度，增強(qiáng)小麥幼苗對(duì)抗Pb2+脅迫傷害的防護(hù)作用，H2O2對(duì)Pb2+脅迫下小麥幼苗的防護(hù)作用在一定程度上體現(xiàn)在MDA含量的減少。而根系活力的上升及微核率的下降也能說(shuō)明H2O2除了能增強(qiáng)抗氧化酶活性外，還能通過(guò)其他機(jī)制增強(qiáng)細(xì)胞活性。

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