超低溫保存對(duì)貴州酥李種子生理生化特性的影響

陳紅　韓曉瑩

摘 要：以貴州酥李種子為試驗(yàn)材料，探討了超低溫保存不同解凍方式對(duì)酥李種子生理生化特性的影響。結(jié)果表明，慢速解凍和快速解凍降低脫氫酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性以及增加丙二醛（MDA）含量，而緩慢解凍中脫氫酶活性和丙二醛含量均無(wú)顯著性變化，其余酶活性降低。因此，適宜酥李種子超低溫保存程序?yàn)榫弮鼍徑狻?/p>

關(guān)鍵詞：酥李種子；超低溫保存；生理生化指標(biāo)

中圖分類(lèi)號(hào)： S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.001

酥李為貴州優(yōu)良地方品種，目前主要以大田種植保存為主，但近年來(lái)，頻繁受到自然災(zāi)害的影響，部分優(yōu)良酥李單株逐漸消失。近些年發(fā)展起來(lái)的超低溫保存為種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存提供了技術(shù)支持。目前，已廣泛應(yīng)用于柑橘[1]、鐵皮石斛[2]、七葉樹(shù)[3]、杏[4]、板栗[5]等種子的超低溫保存。本試驗(yàn)以貴州酥李成熟種子為材料，研究超低溫保存過(guò)程中不同解凍方式對(duì)其生理生化特性的影響，篩選出適宜的解凍方式，以期為酥李種子超低溫保存技術(shù)程序的建立提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為貴州酥李成熟種子，采自貴陽(yáng)市。采后于室溫下自然風(fēng)干，測(cè)定含水量為10.85%。試驗(yàn)中選擇10%二甲基亞砜（DMSO）作為冷凍保護(hù)劑，以不經(jīng)液氮處理的為對(duì)照（CK）。每個(gè)處理25粒，3次重復(fù)。

1.2 冷解凍程序

試驗(yàn)中冷凍方式均采用緩慢冷凍，解凍方式采用緩慢解凍、慢速解凍、快速解凍。具體參照陳禮光等[6]方法。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

脫氫酶活性測(cè)定采用TTC染色法，α-淀粉酶活性測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法，過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用紫外分光光度法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同解凍方式對(duì)脫氫酶活性的影響

脫氫酶活性的強(qiáng)弱，與種子的呼吸作用強(qiáng)度、代謝能力強(qiáng)弱及種胚損傷程度有關(guān)。同時(shí)，還與種子的萌發(fā)呈正相關(guān)。由圖1可知，采用緩解方式種胚的脫氫酶活性為34.46 μg·g-1·mL-1，從數(shù)值上看，甚至比對(duì)照種胚的脫氫酶活性（32.74 μg·g-1·mL-1）略高，與自然狀態(tài)下種胚脫氫酶活性最接近，表明超低溫保存后種胚的活力與自然狀態(tài)下的種胚活力相似。采用慢解和快解方式種胚的脫氫酶活性與對(duì)照相比，均呈下降趨勢(shì)。而種胚慢解與快解之間脫氫酶活性沒(méi)有達(dá)到顯著性差異，但都與對(duì)照達(dá)到了顯著性差異，故不同處理方式對(duì)種子的脫氫酶活性產(chǎn)生了不同的影響。

2.2 不同解凍方式對(duì)α-淀粉酶活性的影響

α-淀粉酶在種子萌發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用，它將種子內(nèi)貯藏大分子物質(zhì)淀粉分解為可吸收利用的小分子物質(zhì)，其活性的高低對(duì)種子萌發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中的能量和各種中間產(chǎn)物的供應(yīng)有很大影響。不同的解凍方式對(duì)種胚的α-淀粉酶的活性影響不同。分析圖2種胚的α-淀粉酶活性，尤以采用快解方式的α-淀粉酶活性最低，為0.58 mg·g-1·min-1，降幅最大，對(duì)照種胚的α-淀粉酶活性為0.89 mg·g-1·min-1，幾乎達(dá)到其1.5倍。緩解與慢解中的α-淀粉酶活性沒(méi)有達(dá)到顯著差異水平，但均與對(duì)照呈顯著性差異。在不同的解凍方式中，α-淀粉酶活性大小為緩解>慢解>快解。

2.3 不同解凍方式對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響

有關(guān)研究表明，在低溫冷害條件下，活性氧自由基的積累超過(guò)閾值時(shí)，膜脂過(guò)氧化就會(huì)發(fā)生，反應(yīng)中還會(huì)伴隨著丙二醛的產(chǎn)生，丙二醛可與蛋白質(zhì)結(jié)合使酶鈍化，與核酸結(jié)合引起染色體變異[7]。因此，丙二醛的含量可以衡量種子的受損程度。試驗(yàn)表明，液氮保存對(duì)種子的膜結(jié)構(gòu)也會(huì)產(chǎn)生不同程度的傷害。由圖3可知，采用快解方式的種胚中丙二醛含量最高，達(dá)2.34 μmol·g-1，幾乎為對(duì)照的3.5倍。說(shuō)明此種解凍方式對(duì)種子的傷害非常嚴(yán)重，其次是慢解為0.69 μmol·g-1。而采用緩解方式的種胚丙二醛含量與對(duì)照無(wú)明顯差別，可能此時(shí)種胚沒(méi)有受到明顯的損傷。對(duì)試驗(yàn)材料的傷害程度依次為快解>慢解>緩解。

2.4 不同解凍方式對(duì)抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 SOD是植物體內(nèi)清除自由基最重要的酶，一般來(lái)說(shuō)，其活性大小能夠作為反映細(xì)胞膜系統(tǒng)完整性的指標(biāo)之一。對(duì)照中SOD的活性為160.53 U·g-1。從圖4中可以看到，與對(duì)照相比，采用不同的解凍方式處理，種胚的SOD活性均有不同程度的下降。采用快速解凍處理后的種胚SOD活性均比其他2種處理方法低，為115.29 U·g-1，僅為對(duì)照的7/10，說(shuō)明其胚細(xì)胞膜系統(tǒng)所受的低溫傷害較嚴(yán)重，胚活力下降，其次是慢解，活性為134.75 U·g-1。同時(shí)，各解凍方式之間的SOD活性差異也很大，其大小依次為緩解>慢解>快解。

2.4.2 對(duì)過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響 過(guò)氧化物酶是種子很重要的抗逆酶，早在20世紀(jì)初就已經(jīng)用POD活性來(lái)衡量種子活力，高活力種子抗逆性酶活力強(qiáng)[7]。圖5中種胚POD活性與對(duì)照中的POD活性491.63 U·g-1·min-1相比，不同解凍處理的種胚POD活性均呈下降趨勢(shì)，尤以種胚快解的POD活性最低，為380.65 U·g-1·min-1。而緩解與慢解種胚的POD活性沒(méi)有達(dá)到顯著性差異，分別為431.71 U·g-1·min-1和419.96 U·g-1·min-1，但都與對(duì)照達(dá)到了顯著性差異。

2.4.3 對(duì)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響 與SOD、POD一樣，CAT也是細(xì)胞內(nèi)重要的抗逆酶，可以清除細(xì)胞內(nèi)多余的過(guò)氧化氫，減輕其對(duì)膜脂的傷害能力。由圖6可知，各解凍方式對(duì)種胚CAT活性的影響不同。所有解凍處理中，采用快速解凍方式的CAT活性最低，為1.27 U·g-1·min-1，降幅最大，與對(duì)照及各處理間均達(dá)到了顯著差異水平。采用緩解方式的CAT活性為2.40 U·g-1·min-1，慢解方式的CAT活性為2.27 U·g-1·min-1，兩者之間并沒(méi)有達(dá)到顯著性差異。

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)種子的酶活性及丙二醛含量等方面的測(cè)定，探討了超低溫保存對(duì)貴州酥李種子生理生化特性的影響。脫氫酶活性是檢驗(yàn)種子活力的方法之一，脫氫酶活性的下降，導(dǎo)致種子萌發(fā)力的下降。緩解中脫氫酶活性比對(duì)照略高，說(shuō)明超低溫保存后的種子細(xì)胞還原能力提高，可能此時(shí)尚未對(duì)酥李種子造成嚴(yán)重的冷凍傷害。陳禮光等[8]的研究表明，在緩凍緩解方式下，能夠提高錐栗離體胚脫氫酶活性。超低溫保存對(duì)種子的某些性能具有一定的促進(jìn)作用。在杉木種子[9]和南瓜種子[10]的保存研究中，超低溫保存能夠提高其萌發(fā)力，而本試驗(yàn)中緩慢冷凍方式種子的活力并沒(méi)有提高，對(duì)于快速冷凍和慢速冷凍是否有助于酥李種子活力的提高，有待深入的探索。

在溫度發(fā)生驟變時(shí)會(huì)影響到種子內(nèi)部的生理活動(dòng)，尤以硬實(shí)種子最明顯，內(nèi)果皮會(huì)炸裂，但是如果采取合理而有效的冷凍方式和解凍方式，并輔以冷凍保護(hù)劑的處理，便可有效地減小因?yàn)闇囟鹊募眲∽兓瘜?duì)種子造成的傷害，使種子保持較高的活力。有研究表明，閩粵栲離體胚超低溫保存時(shí)采用冷凍保護(hù)劑為15%二甲亞砜+10%蔗糖+10%聚乙二醇的快凍快解組合方法最佳[6]。史鋒厚等[11]認(rèn)為超低溫貯藏油松種子時(shí)以10%二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑，采用快速冷凍、慢速解凍的處理組合最佳。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)緩解方式明顯優(yōu)于其他幾種解凍方式，脫氫酶及SOD均比其他幾種解凍方式種子的活性高，且用自然含水量的種子進(jìn)行超低溫保存，種子的萌發(fā)力未降低。在幾種解凍方式中，不同解凍速度對(duì)保存效果影響不同，導(dǎo)致的低溫傷害程度也不同，雖然抗氧化酶活性均有不同程度的下降，但是尤以快速解凍方法對(duì)種子的傷害最大，丙二醛含量最高。綜合分析可知，適合自然含水量狀態(tài)下酥李種子超低溫保存的處理組合為緩凍緩解。

參考文獻(xiàn)：

[1] Graiver N，Califano A，Zaritzky N.Partial dehydration and cryopreservation of citrus seeds[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91（14）：2544-2550.

[2] 王君暉，張毅翔，劉峰，等.鐵皮石斛種子、原球莖和類(lèi)原球莖體的超低溫保存研究[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（1）：59-61.

[3] 任淑娟，王航，劉潔，等.七葉樹(shù)種子離體胚的超低溫保存[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，34（2）：19-23.

[4] Malik S K，Chaudhury R.Cryopreservation of seeds and embryonic axes of wild apricot （Prunus armeniaca L.）[J].Seed Science and Technology，2010，38（1）：231-235.

[5] 鄭郁善，陳禮光，李慶榮.板栗種子超低溫保存研究[J].林業(yè)科學(xué)，2002，38（6）：146-149.

[6] 陳禮光，鄭郁善.閩粵栲種子和離體胚超低溫保存效果研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（4）：571-575.

[7] 高榮岐，張春慶.種子生物學(xué)[M].北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[8] 陳禮光，鄭郁善.錐栗種子離體胚超低溫保存脫氫酶活性研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（1）：32-35.

[9] 陳禮光，高培軍，謝安強(qiáng)，等.杉木種子超干燥和超低溫貯藏研究[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25（4）：113-117.

[10] 蔣燕，郝文利，田野.液氮保存對(duì)南瓜種子生理生化特性的影響[J].北方園藝，2009（2）：77-79.

[11] 史鋒厚，喻方圓，沈永寶，等.超低溫貯藏對(duì)油松種子的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，29（6）：119-122.