維生素C和維生素E聯(lián)合應(yīng)用對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

彭燕　程也　張斯文

【摘要】目的：觀察維生素c（Vitc）和維生素E（VitE）以及VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：采用夾閉腎蒂1h進(jìn)行并再通進(jìn)行缺血再灌注損傷的造模，再灌注前10min在不同分組的大鼠進(jìn)行舌下靜脈注入Vit（200mg/kg）；VitE乳劑（100mg/kg）以及vit（200mg/kg）和VitC聯(lián)合使用。再灌注2h后測定腎組織勻漿MDA含量及SOD活性，血肌酐，尿素等指標(biāo)從而觀察缺血再關(guān)注損傷程度及藥物保護(hù)作用。結(jié)果：VitC給藥組、VitE給藥組以及VitC、E聯(lián)合給藥組的腎組織勻漿SOD活性明顯高于模型組。其中以VitC、E聯(lián)合給藥組最為顯著（p<0.01）；MDA，血肌酐，血尿素值均低于模型組（p<0.05），以VitC、E聯(lián)合給藥組改善最為顯著（p<0.01）。VitC、E聯(lián)合給藥組與VitE給藥組和VitC給藥組相比也有顯著差異（p<0.05）。結(jié)論：VitC和VitE對腎缺血再灌注損傷具有協(xié)同保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】維生素C；維生素E；缺血再灌注損傷

【中圖分類號】R151.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1007-8517（2013）10-0023-03

腎缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion Injury，/RI）是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象，腎臟的移植是產(chǎn)生腎臟缺血再灌注損傷的主要情形。其中自由基損傷和脂質(zhì)過氧化是缺血再灌注損傷的主要機(jī)制。對于。腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)藥物近年來也在不斷的研究與開發(fā)之中，Nakaga-wa和Cicalese證實(shí)了利用超氧化物歧化酶（sOD）和還原性谷胱甘肽的抗自由基及脂質(zhì)過氧化作用。但是由于SOD的來源受限以及價(jià)格比較昂貴，谷胱甘肽的作用發(fā)生需要阿爾法硫辛酸的存在下放能發(fā)揮作用。

因此我們可以考慮同樣具有抗氧化作用且方便而且價(jià)格便宜對人體副作用比較小的維生素c和維生素E作為缺血再灌注損傷的保護(hù)藥。

研究顯示，再灌注前經(jīng)脈注射VitC和（或）VitE乳劑可有效保護(hù)大鼠肺的缺血再灌注損傷，表現(xiàn)在組織損傷程度降低，肌酐尿素氮升高水平得到控制。但是VitC和VitE對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)效果以及聯(lián)合運(yùn)用效果和與其它陽性藥物效果的比較目前缺少報(bào)道。因此我們用大鼠復(fù)制了腎缺血再灌注模型，進(jìn)行VitC和VitE乳劑以及聯(lián)合用藥對缺血再灌注保護(hù)作用的研究，通過檢測血肌酐、尿素氮、SOD和MDA等指標(biāo)對動(dòng)物缺血再灌注損傷程度進(jìn)行檢測。

1、材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠120只（健康狀況良好），體重232±10.8g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。平均分為6組，每組20只。1組為假手術(shù)組（開腹不接扎腎蒂），給予生理鹽水注射0.5ml；2-6組進(jìn)行缺血再灌注造模處理（結(jié)扎腎動(dòng)脈60min）：其中2組每只給谷胱甘肽2mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；3組每只給維生素c 200mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；4組每只給維生素E 100mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；5組為維生素c、E聯(lián)合給藥，每只給維生素c 200mg/kg、維生素E 100mg/kg，加生理鹽水至0.5ml；6組為模型組，給予生理鹽水每只0.5ml。

1.2 主要藥品與試劑 VitC；購自長春亞泰藥業(yè)集團(tuán)（批號：20090803）；VitE；購自長春亞泰藥業(yè)集團(tuán)（批號：20090815）；還原性谷胱甘肽：購自重慶藥友制藥有限責(zé)任公司（批號：20100321）；MDA試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090923）；尿素氮試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090925）；肌酐（cr）試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090809）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：購自長春生物制品所（批號：20090703）。

1.3 復(fù)制缺血再灌注損傷模型 3%的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。腹腔注射20%烏拉坦0.5ml/100g，麻醉徹底后，大鼠按仰臥位固定，經(jīng)腹腔入路。從大鼠腹側(cè)正中劍突下方向下開一約5em的口，將腸管翻至體外，找到兩側(cè)腎臟后，用結(jié)扎線結(jié)扎腎蒂，結(jié)扎線系活結(jié)，結(jié)扎完畢后將腸管還納，用止血鉗將切口鉗住。皮下注射少量生理鹽水。結(jié)扎時(shí)間為60min，再灌注前10min進(jìn)行舌下靜脈給藥。手術(shù)結(jié)束后，切口周圍用青霉素消毒，之后進(jìn)行縫合。給藥2小時(shí)后，準(zhǔn)備進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。之后打開腹腔。分離暴露腹主動(dòng)脈，用注射器直接穿刺動(dòng)脈采血5ml用于血漿中MDA，肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的檢測。之后繼續(xù)抽血，處死動(dòng)物。同時(shí)分離左腎，取腎上極組織0.5g，用4.5ml生理鹽水在4℃下用電動(dòng)勻漿機(jī)以12000r/min研磨制成10%腎組織勻漿。

1.4 指標(biāo)測定 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定腎組織MDA含量，SOD含量，血肌酐含量，學(xué)尿素氮含量，腎組織形態(tài)學(xué)觀察，取腎下極組織，置于4%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用X²檢驗(yàn)。

2、結(jié)果

2.1 MDA的測量值 MDA吸光度的測量結(jié)果見表1，計(jì)算后的MDA值見表2。

經(jīng)計(jì)算后的MDA值在假手術(shù)組最低，并且在模型組最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測T檢驗(yàn)表明：經(jīng)維生素C和維生素E處理后的動(dòng)物的MDA值低于模型組（六組）P<0.05；經(jīng)維生素C和維生素E處理后MDA值低于維生素C組和維生素E組，P

2.2 血肌酐的測量值 血肌酐測量值見表3，經(jīng)計(jì)算后的MDA值在假手術(shù)組最低，并且在模型組最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測T檢驗(yàn)表明：經(jīng)維生素C和維生素E處理后的動(dòng)物的MDA值低于模型組（六組）P<0.05；經(jīng)維生素C和維生素E處理后MDA值低于維生素C組和維生素E組，P<0.05。

2.3 血尿素的測量值 血尿素的測量值見表4：計(jì)算后的MDA值在假手術(shù)組最低，并且在模型組最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測T檢驗(yàn)表明：經(jīng)維生素C和維生素E處理后的動(dòng)物的MDA值低于模型組（六組）P<0.05。

2.4 各組大鼠腎組織HE染色病理改變 光鏡下可見假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)未見明顯異常。模型組大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，部分腎小管管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)可見蛋白性液體、紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片，腎間質(zhì)高度充血、炎細(xì)胞浸潤明顯。

其余3個(gè)治療組腎組織病變與缺血再灌注組比較均有所減輕，僅見少部分腎小管管腔擴(kuò)張，偶見管型，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤不明顯。上述各組均未見腎小球明顯病理改變。

3、討論

由于缺血再灌注損傷主要機(jī)制為自由基損傷和脂質(zhì)過氧化等等。因此，缺血再灌注損傷的治療和實(shí)驗(yàn)研究方面多圍繞這兩個(gè)方面展開。SOD活力的高低間接反映機(jī)體清除自由基的能力，而MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。血肌酐和尿素氮是反應(yīng)腎損傷的敏感指標(biāo)，可間接反應(yīng)腎臟受缺血再灌注損傷的程度。

3.1 維生素c及維生素E對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在給予維生素C和維生素E的處理后，SOD，MDA，肌酐和血尿素的數(shù)值有了顯著的改善，表明它們具有顯著的抗氧化作用。結(jié)果與梁應(yīng)平和蔡虹靜等研究結(jié)果基本一致。

由于維生素C具有重要的抗氧化性，它還能防止脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)維生素E循環(huán)再生，清除體內(nèi)自由基和活性氧物質(zhì)，防止癌癥的發(fā)生和惡化。維生素c的多項(xiàng)生理功能都與其抗氧化性有關(guān)。作為一種天然的水溶性抗氧化劑，它能直接清除生理代謝過程中產(chǎn)生的過量自由基，使機(jī)體免受損害。維生素E是O^-₂的直接清除劑，與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物一起構(gòu)成體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的核酸免受自由基的攻擊。報(bào)道維生素E能保護(hù)LDL免遭氧化損傷，可有效拮抗氧化型低密度脂蛋白刺激Ca²⁺攝入的作用，而LDL可能正是血管氧化損傷的主要成分。

3.2 維生素C與維生素E聯(lián)合應(yīng)用對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 通過MDA值的計(jì)算（表2），在VitCE聯(lián)合用藥處理組（5組）的MDA值顯著低于模型組（6組）；并且5組與3組和4組也有顯著的差異（P<0.05），表明維生素CE聯(lián)合應(yīng)用后對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用要明顯好于直接應(yīng)用維生素C或維生素E。

同時(shí)血尿素和血肌酐的測定結(jié)果表明（表3，表4）：VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用后與維生素C或維生素E單獨(dú)使用相比具有更好的缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

其中VitE單獨(dú)使用對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用較低（SOD值較低，MDA，肌酐，尿素氮值較高），這可能與VitE-自由基還原成VitE，有助于/VitE的再生O，從而發(fā)揮協(xié)同抗氧化功能。

而維生素CE聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同抗缺血再關(guān)注的機(jī)制尚不清晰?？赡芘c以下機(jī)制有關(guān)：

第一：維生素C和維生素E都是抗氧化劑，均具有抗自由基損傷和紙質(zhì)過氧化的功能，起協(xié)同作用。同時(shí)由于VitC為水溶性，VitE為脂溶性，他們的聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同效果；第二：由于維生素E的存在也能防止維生素C的氧化，保證在體內(nèi)的生理功能，如維生素E能直接接受自由基的氧化，從而預(yù)防和消除Fe²⁺和Cu²⁺所引起的維生素c的不良反應(yīng)。同時(shí)，VC具有重要的抗氧化性，當(dāng)VitE（生育酚）與自由基起反應(yīng)后，即轉(zhuǎn)變?yōu)樯恿u基自由基，此化合物可被維生素c重新還原為生育酚，重新發(fā)揮其抗氧化作用；第三：預(yù)先給予VitC對組織中脂質(zhì)過氧化物（LPO）的生成有一定的抑制作用，且VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果更好，同時(shí)也增加超氧化物歧化酶活性。

4、討論

目前關(guān)于缺血再灌注損傷的保護(hù)藥主要以超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽、亞硝酸納等藥物為主。但是它們在使用上都有一定的局限性，SOD的價(jià)格以及還原型谷胱甘肽的易氧化性使得它們的臨床應(yīng)用還具有一定的弊端。亞硝酸鈉通過NO對缺血再灌注起到保護(hù)作用同樣面臨易被氧化，此外，亞硝酸鹽類物質(zhì)的毒性不可忽略。VitC和VitE的聯(lián)合使用使它們的治療效果大大提升，以至基本接近亞硝酸鈉的水平，并且它們的來源方便，對人體沒有危害較小，同時(shí)，VitC和VitE具有的美自和滋潤肌膚等功效也會(huì)使它們的功能復(fù)合化和多元化，因此會(huì)在臨床上預(yù)防和治療缺血再灌注損傷有著很好的應(yīng)用前景。但是，考慮到VitC和VitE的溶解性存在一定的差異，在復(fù)方制藥上會(huì)有一定的難度，同時(shí)，VitC和VitE的相互作用機(jī)制還需要深層次的探討以及聯(lián)合用藥缺少臨床的實(shí)際觀察，因此，VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用于缺血再灌注損傷還需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。