液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿中苯乙醇胺A

董文婷 朱曦 梁利妹 萬珊

摘要：建立了一種超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿中苯乙醇胺A的方法。豬尿樣品以萊克多巴胺—D3為內(nèi)標(biāo)，尿液經(jīng)酶解提取后經(jīng) MCX固相萃取柱凈化，超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定。苯乙醇胺A監(jiān)測離子為m/z 344.7>149.5和m/z 344.7>326.7。結(jié)果表明在1～100 ng/mL范圍內(nèi)苯乙醇胺A呈良好的線性關(guān)系，高中低濃度相對回收率在98.8%～118.0%，變異系數(shù)小于10%，定量限為0.2 ng/mL。該方法用同位素內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確，適用于豬尿中苯乙醇胺A的殘留測定。

關(guān)鍵詞：豬尿；苯乙醇胺A；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；同位素內(nèi)標(biāo)法

中圖分類號：S851.34 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）06-0009-02

苯乙醇胺A，又稱作克倫巴胺。它是福莫特羅的同分異構(gòu)體，是在合成萊克多巴胺時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，具有和萊克多巴胺相同的作用和效果，屬于β-激動劑的一種。

苯乙醇胺A作為β-激動劑，將其添加到飼料中，可以增加動物的瘦肉量、減少飼料的使用、節(jié)約成本，是一種新型違禁藥物。

苯乙醇胺A，分子式為C19H24N2O4 ， 化學(xué)式為2-[ 4-（ 4-硝基苯基） 丁基-2-羥基氨基] -1-（4-為甲氧基苯基）乙醇， 化學(xué)結(jié)構(gòu)式2-（ 4-（ nit- rophenyl ） butan-2-ylamino ）-1-（ 4-methox yphenyl） ethanol。其結(jié)構(gòu)式見圖1。

萊克多巴胺的結(jié)構(gòu)式見圖2。

通常實(shí)驗(yàn)室β-激動劑的確證方法有：LC-MS-MS法和GC-MS法[1]，農(nóng)業(yè)采用有LC-MS法檢測動物尿液中β-激動劑[2]，上海飼料中心近年來發(fā)布了飼料中苯乙醇胺A的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法[3]。本文采用酶解方法，經(jīng)前處理后干擾雜質(zhì)少，再通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬尿中苯乙醇胺A，該方法用同位素內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于作苯乙醇胺A的殘留確證分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（ UPLC Quattro Premier） ，美國Waters 公司； AE260電子天平， Mettler-toledo公司；HimacCF16RX 高速冷凍機(jī)，HITACHI 公司；SIR4 漩渦振蕩器，IKA 公司；Toledo 320酸度計(jì)，Mettler-toledo公司； PIERCE IL61105 樣品濃縮器； MCX固相萃取柱， 60 mg/ 3 mL，美國Waters 公司；0.22 μm微孔濾頭。

1.2 藥品、試劑與材料

苯乙醇胺A，純度96.0%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；同位素內(nèi)標(biāo)萊克多巴胺（Ractopamine - d3）購自 Dr1Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸為色譜純； 氫氧化鈉、氨水、乙酸乙酯為分析純；水為超純水，美國MILLIPORE 超純水儀自制；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶 /芳基硫酸酯酶（β-Glucuro-nidase/ aryl sulfatase）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液的制備（100 μg/mL）

準(zhǔn)確稱取苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg至100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即含苯乙醇胺A 100 μg/mL，于-20 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液A的制備（100 ng/mL）：精密量取0.10 mL儲備液至100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作液B的制備（10 ng/mL）：精密量取5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液A至50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

同位素內(nèi)標(biāo)儲備液的制備（100 μg/mL）：稱取 10 mg的萊克多巴胺同位素內(nèi)標(biāo)置于100 mL棕色容量瓶中 ，用甲醇溶解并定容，于- 20 ℃條件下保存。

同位素內(nèi)標(biāo)工作液的制備（100 ng/mL）：精密量取0.10 mL儲備液至100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITYUPLC BEHC18柱 （50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；流動相A：0.1%甲酸甲醇溶液，流動相B：0.1%甲酸水溶液；流速0.2 mL/min；線性流動相梯度洗脫條件： 0 min，B：80%；0～1 min，B： 80%～20%；1～3 min，B： 20%～80%；線性變換。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離（ESI+） ； 掃描方式：正離子掃描； 檢測方式：MRM（ 多反應(yīng)監(jiān)測）；毛細(xì)管電壓： 3.2 kV，錐孔電壓： 25 V；離子源溫度： 110 ℃；霧化氣溫度： 350 ℃；霧化氣流量： 650 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；光電倍增器：650 V。

1.4.3 樣品前處理

（1）酶解。準(zhǔn)確量取樣品5mL于50 mL離心管中，加入 2 mol/L 乙酸銨溶液（ pH5.2） 0.5 mL， 再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶 /芳基硫酸酯酶40 μL， 渦旋混勻， 于37 ℃ 下避光水浴振蕩16 h。

（2）提取。酶解后放置至室溫， 添加100 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液100 μL于待測樣中，渦旋混勻，10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL離心管內(nèi)。用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.8±0.2，加入10 mL乙酸乙酯，再加入1.5 g 氯化鈉固體飽和水相，渦旋混勻后振蕩10 min，5 000 r/min 離心5 min，吸取上層有機(jī)溶劑于離心管中，再加入10mL乙酸乙酯，同前操作，合并提取液；氮?dú)獯蹈桑?0 ℃）。用5 mL 2 mol/ L的乙酸銨溶液（pH5.2）溶解殘余物，備用。

（3）凈化。MCX 固相萃取柱依次用甲醇、水、0.2%甲酸各3 mL 活化，然后將備用液過柱；依次用水、0.2%甲酸、甲醇各3 mL 淋洗，減壓抽干MCX小柱；再用5%氨化甲醇5 mL 洗脫，收集洗脫液，50 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.5 mL甲醇-0.1%甲酸/水（5+95，V/V）溶液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

（1）苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品和加標(biāo)樣品特征離子在上述儀器條件下，保留時(shí)間為1.85 min。結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)，空白組織對被測物無任何干擾。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。分別取適量苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得1、2、5、10、20、50、100 ng/mL 7 個(gè)濃度點(diǎn)的對照溶液（內(nèi)標(biāo)均為20 ng/mL）。以苯乙醇胺A和內(nèi)標(biāo)物的濃度比為橫坐標(biāo)，二者定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)，得到苯乙醇胺A的標(biāo)準(zhǔn)曲線。苯乙醇胺A在1～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程為y=33.834x+6.020 7，r=0.996 5。

（3）靈敏度的確定。將苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)工作液分別添加到3份空白豬尿中，制成濃度為0.1、0.2、0.5 ng/mL的添加樣品，經(jīng)1.4.3方法處理后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，計(jì)算特征離子信噪比（S/N），當(dāng)濃度為0.2 ng/mL（S/N大于10）為方法定量限，濃度為0.1 ng/mL（S/N大于3）為方法檢測限。

（4）準(zhǔn)確度和精密度的確定。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白豬尿中添加0.5 ng/mL、2.0 ng/mL、10.0 ng/mL 3個(gè)不同濃度藥物（內(nèi)標(biāo)濃度均為2.0 ng/mL）進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5 個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表1可知，該方法平均回收率為 98.8%～ 118.0%，批內(nèi)RSD< 10%，批間RSD<10%。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用 100 ng/mL 的苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式以多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù) ，在正離子模式下，化合物全掃描的分子離子[M+H] 最理想。選擇目標(biāo)母離子 ，對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、霧化氣溫度、離子能量等條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定質(zhì)譜參數(shù)后，進(jìn)行子離子掃描并優(yōu)化各子離子的碰撞能量。每個(gè)物質(zhì)選擇兩個(gè)子離子，其中響應(yīng)值較高的子離子作為定量離子，另一個(gè)作為輔助定性離子。