端粒酶活性、PCNA在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

丁敏等

摘 要 目的：探討端粒酶活性和增殖細(xì)胞核抗原在乳腺癌中的表達(dá)關(guān)系及聯(lián)合檢測對乳腺癌早期診斷及預(yù)后評估的臨床意義。方法：采用TRAP-PCR-ELISA與S-P法檢測乳腺癌組織81例，乳腺癌癌旁組織37例，乳腺良性病變組織11例的端粒酶活性和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)。結(jié)果：81例乳腺癌組織、37例乳腺癌癌旁組織中端粒酶表達(dá)陽性率分別為74.1%和10.8%，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，11例良性病變組織中未測出端粒酶活性；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分型與端粒酶陽性表達(dá)率，P>0.05差異無統(tǒng)計學(xué)意義。81例乳腺癌組織PCNA的表達(dá)率71.6%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PCNA陽性表達(dá)率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組增高（P<0.05），且呈正相關(guān)；端粒酶活性與PCNA表達(dá)的一致率92.24%，呈正相關(guān)。結(jié)論：端粒酶活性與PCNA聯(lián)合檢測，在乳腺癌早期診斷及預(yù)后評估方面有重要的臨床意義。

關(guān)鍵詞 端粒酶 增殖細(xì)胞核抗原 乳腺癌

目前在婦女的惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率已高居第1位[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，端粒酶做為新的腫瘤標(biāo)志物和抗癌靶點(diǎn)，逐漸成為乳腺癌研究的新熱點(diǎn)，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）用于肺癌的研究較多，近年也用于乳腺癌的研究，但兩者聯(lián)合研究的文章較少，本文對81例乳腺癌組織，37例乳腺癌癌旁組織及11例乳腺良性病變組織的端粒酶活性及與增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的關(guān)系通過檢測后進(jìn)行探討，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

2010年1月～2011年6月手術(shù)切除標(biāo)本129例，乳腺癌及良性病變組織均經(jīng)病理確診，均為女性，年齡30～72歲，其中，乳腺良性病變組織11例，乳腺癌旁（離腫瘤距離>2cm）組織37例，乳腺癌81例，術(shù)前均未做放化療。

方法：端粒酶活性檢測：檢測試劑盒為端粒酶活性檢測試劑盒。方法如下：取細(xì)胞105～106加裂解液20μl混勻后冰浴30分鐘，1600r/分4℃離心20分鐘，取上清175μl置-80℃冰箱備用。提取液1～2μl內(nèi)依次加入TRAP PCR擴(kuò)增液25μl；無菌DEPC補(bǔ)足至50μl混勻；再按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：預(yù)變性94℃ 5分鐘，變性95℃ 30秒，退火55℃ 30秒，延伸72℃ 90秒，循環(huán)30次最后延伸72℃ 10分鐘。取5μl PCR產(chǎn)物加20μl變性試劑混勻放置10分鐘后加入225μl雜交液混勻再取出100μl移入包被于抗地高辛的酶標(biāo)板內(nèi)室溫下作用2小時，加入抗地高辛過氧化物酶，與底物作用30分鐘終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定波長450nm的吸光度值。

PCNA檢測：采用免疫組織化學(xué)S-P法染色。操作方法照試劑盒說明書：經(jīng)10%福爾馬林固定并石蠟包埋。4μm連續(xù)切片。二甲苯脫蠟、梯度酒精至水化后進(jìn)行5～8分鐘熱處理，過氧化物酶阻斷血清封閉，分別加Ⅰ抗60分鐘及Ⅱ抗Ⅲ抗15分鐘，均PBS液洗2分鐘/3次；DAB顯色5～10分鐘，蘇木素復(fù)染5～10秒后脫水。透明膠封片。

結(jié)果判定：端粒酶以吸收度>0.20即為陽性。PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰的棕色或棕黃色顆粒即為陽性，每例切片最少觀察5個高倍視野。

統(tǒng)計學(xué)處理：本次研究所得數(shù)據(jù)均由SPSS13.0軟件統(tǒng)計包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組計數(shù)資料或療效比較采用X2檢驗(yàn)，組間對比采用t檢驗(yàn)，以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

端粒酶陽性表達(dá)率與乳腺癌組織分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，見表1。

PCNA陽性表達(dá)率與乳腺癌組織分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，見表2。

討 論

端粒酶是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長的一種酶，它可以讓端粒不會因細(xì)胞分裂而有所損耗，使得細(xì)胞分裂克隆的次數(shù)增加。其在正常人體組織中被抑制，在腫瘤中被重新激活，使癌癥得以發(fā)展惡性轉(zhuǎn)化[2]。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中端粒酶陽性表達(dá)率較乳腺癌癌旁組織及良性病變組織中顯著增高，P<0.05差異有統(tǒng)計意義。而乳腺良性病變組織中無端粒酶活性的表達(dá)。端粒酶陽性表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織類型無關(guān)系，與俞喬報道的基本一致[3]，與高金波[4]。