紅花蜂花粉多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性質(zhì)研究

左紹遠(yuǎn)　錢(qián)金栿

摘要：采用水提醇沉法從紅花（Carthamus tinctorius L.）蜂花粉中提取多糖，以多糖提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取的工藝條件，并觀察紅花蜂花粉多糖在體外的抗氧化作用。結(jié)果表明，紅花蜂花粉多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時(shí)間12 h、料水質(zhì)量比1∶15；此工藝條件下多糖平均得率為2.35%。體外抗氧化結(jié)果表明，紅花蜂花粉多糖對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）有一定的清除作用。

關(guān)鍵詞：紅花（Carthamus tinctorius L.）蜂花粉多糖；提取；正交試驗(yàn)；抗氧化

中圖分類號(hào)：S646；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1631-03

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科紅花屬一年生草本植物，味辛、性溫，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛等功效[1，2]，是一種傳統(tǒng)中藥。紅花在中國(guó)的人工種植歷史悠久，新疆維吾爾自治區(qū)、云南省和四川省是紅花的主產(chǎn)區(qū)，尤其在滇西地區(qū)紅花已大量推廣種植，成為新的蜜源植物，紅花蜂花粉的產(chǎn)量逐年上升，已成為滇西地區(qū)新的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一。多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子物質(zhì)，具有多種復(fù)雜的生物學(xué)活性。研究表明，不同來(lái)源的多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)血糖、降血脂及抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種活性[3，4]，多糖類已成為功能性食品和新藥物資源的研究熱點(diǎn)之一。目前對(duì)蜂花粉多糖研究較多[5]，但關(guān)于紅花蜂花粉多糖的研究少見(jiàn)報(bào)道。為綜合開(kāi)發(fā)利用云南省豐富的紅花蜂花粉資源，對(duì)紅花蜂花粉多糖的分離提取工藝及其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為擴(kuò)大紅花蜂花粉的用途及促進(jìn)紅花蜂花粉深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品，乙醇、丙酮、乙醚等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。破壁紅花蜂花粉為云南滇峰蜂業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品（批號(hào)：20100902）。

主要儀器包括HH-W420/600恒溫水浴箱（金壇市瑞華儀器有限公司）、AG 135電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、FD-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司）、UV2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津蘇州儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[6] 精確稱取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg置100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液10.0 mL置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（100 μg/mL）。精確吸取應(yīng)用液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL，分別置于具塞試管，加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%的苯酚1.0 mL，各管迅速加5.0 mL濃H2SO4，搖勻，沸水加熱10 min，迅速流水冷卻，另取2.0 mL蒸餾水同法操作，加入試劑作空白對(duì)照，在490 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖質(zhì)量濃度（C）在10～80 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度A490 nm有較好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.006 1C+0.007 2，r2=0.998 4。

1.2.2 紅花蜂花粉多糖的提取工藝流程與多糖提取率的測(cè)定 稱取破壁紅花蜂花粉150.0 g，分別用石油醚、95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇回流2次，每次2 h。濾渣加蒸餾水水浴浸提2次，合并濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積后加95%的乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，醇沉，置4 ℃過(guò)夜，離心，沉淀用Sevage法脫蛋白[6]至280 nm處無(wú)明顯吸收峰后再次醇沉，沉淀用蒸餾水透析12 h，醇沉，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，-20 ℃冷凍干燥至恒重，得紅花蜂花粉粗多糖樣品，置玻璃干燥器中備用。精確稱取紅花蜂花粉粗多糖樣品100.0 mg，按“1.2.1”方法操作，測(cè)定吸光度。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗多糖樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

多糖提取率=多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)×粗多糖樣品質(zhì)量/蜂花粉質(zhì)量（干重）×100%

1.2.3 正交試驗(yàn) 選擇提取時(shí)間、提取溫度、料水質(zhì)量比為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表1），以紅花蜂花粉多糖提取率為考察指標(biāo)，篩選最佳提取條件。

1.2.4 紅花蜂花粉多糖對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用[7，8] 將多糖樣品配制為濃度分別為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的溶液，各取1.0 mL，分別加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇各1.0 mL，對(duì)照組以蒸餾水1.0 mL代替多糖溶液。最后加8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴反應(yīng)0.5 h后以蒸餾水調(diào)零，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以不加H2O2的多糖溶液作為本底管，維生素C作陽(yáng)性對(duì)照品，同法操作。每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)平行管，結(jié)果取平均值。

清除率=（A0-Ax-Ax0）/A0×100%

式中，A0為對(duì)照組吸光度，Ax為多糖樣品吸光度，Ax0為本底管吸光度。

1.2.5 紅花蜂花粉多糖對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定[9，10]。多糖樣品溶液配制同“1.2.4”，取pH 8.2的Tris-HCl緩沖液0.50 mL于具塞試管，加不同質(zhì)量濃度的多糖溶液1.0 mL置25 ℃水浴保溫20 min后，再加入在25 ℃預(yù)熱的5.0 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后25 ℃水浴4 min，快速搖勻，在325 nm處以pH 8.2的Tris-HCl緩沖液調(diào)零，每隔30 s測(cè)定1次吸光度，連續(xù)測(cè)定4 min，計(jì)算加入多糖樣品后的自氧化速率△Ax?？瞻讓?duì)照組以1.0 mL蒸餾水溶液代替多糖樣品，測(cè)定自氧化速率△A0。以維生素C作陽(yáng)性對(duì)照同法操作。

自氧化速率=（最后一次測(cè)定的吸光度-第一次測(cè)定的吸光度）/4

清除率=（△A0-△Ax）/△A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花蜂花粉多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

紅花蜂花粉多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由極差分析可知各因素對(duì)多糖提取率的影響由大到小依次為提取溫度、提取時(shí)間、料水質(zhì)量比。最佳試驗(yàn)組合為A3B3C3，即提取溫度90 ℃、浸提時(shí)間12 h、料水質(zhì)量比1∶20。方差分析結(jié)果表明提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響顯著（P<0.05），而料水質(zhì)量比對(duì)提取率的影響不顯著（P>0.05）。這可能是由于原料為破壁蜂花粉，水溶性多糖容易浸出，故料水質(zhì)量比對(duì)提取率的影響相對(duì)較小。由于增加提取劑水的用量會(huì)使后續(xù)減壓濃縮、醇沉等工藝的成本增加，故從實(shí)際出發(fā)，本試驗(yàn)選擇料水質(zhì)量比為1∶15，此條件下紅花蜂花粉多糖的提取率為2.386%，高于其他正交試驗(yàn)組合的結(jié)果。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，多糖提取率分別為2.38%、2.27%、2.41%，平均提取率為2.35%（RSD=2.56%），表明優(yōu)化的工藝組合具有較高的提取率，工藝穩(wěn)定可行。

2.2 紅花蜂花粉多糖對(duì)·OH的清除作用

紅花蜂花粉多糖對(duì)·OH的清除試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)紅花蜂花粉多糖和維生素C對(duì)·OH的清除率隨其質(zhì)量濃度的升高而上升。質(zhì)量濃度低于0.30 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)·OH的清除率較低，而多糖質(zhì)量濃度從0.30 mg/mL增加到0.40 mg/mL，清除率從10.50%迅速上升至36.56%，在質(zhì)量濃度為0.60 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)·OH的清除率為56.23%，是相同質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照品維生素C對(duì)·OH清除率的74%。

2.3 紅花蜂花粉多糖對(duì)O2-·的清除作用

紅花蜂花粉多糖對(duì)O2-·的清除試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨紅花蜂花粉多糖和維生素C質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)O2-·的清除率逐漸上升，且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。在多糖質(zhì)量濃度為0.60 mg/mL時(shí)，其對(duì)O2-·的清除率為47.36%，是相同質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照品維生素C對(duì)O2-·清除率的64%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)考察了水提醇沉法提取紅花蜂花粉多糖的工藝條件，優(yōu)化的工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時(shí)間12 h、料水質(zhì)量比1∶15，在該條件下多糖提取率為2.35%，為紅花蜂花粉多糖的開(kāi)發(fā)和利用提供了試驗(yàn)依據(jù)。體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，紅花蜂花粉多糖具有一定的清除·OH和O2-·的作用，且在試驗(yàn)范圍內(nèi)其清除能力隨多糖質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。但在相同的質(zhì)量濃度下，多糖對(duì)·OH和O2-·的清除率低于維生素C，表明多糖在體外的抗氧化能力弱于維生素C。但多糖作為一種純天然抗氧化物質(zhì)，具有毒副作用小、來(lái)源廣等特點(diǎn)，因而可長(zhǎng)期使用[11，12]。有關(guān)紅花蜂花粉多糖的生物學(xué)活性及單糖組成、結(jié)構(gòu)等尚待進(jìn)一步研究。

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