疊氮鈉對(duì)小麥葉片DNA損傷的彗星實(shí)驗(yàn)

龐振凌　黃鵬　田亞楠

摘要：以小麥（Triticum aestivum Linn.）為材料，以不同濃度梯度的疊氮鈉溶液處理小麥葉片后，采用彗星實(shí)驗(yàn)研究疊氮鈉對(duì)小麥的遺傳損傷。結(jié)果表明，疊氮鈉能引起小麥基因的損傷，并隨濃度的增加傷害程度加大，表明疊氮鈉有明顯的遺傳損傷毒性，彗星實(shí)驗(yàn)可以利用植物細(xì)胞快速檢測(cè)環(huán)境中對(duì)遺傳物質(zhì)有毒性的物質(zhì)，是一種快速、簡(jiǎn)單、直接檢測(cè)DNA損傷的手段。

關(guān)鍵詞：彗星實(shí)驗(yàn)；疊氮鈉；小麥（Triticum aestivum Linn.）；遺傳損傷

中圖分類號(hào)：X173；S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1502-03

目前，致突變物的檢測(cè)是環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容之一。過(guò)去大量采用微核試驗(yàn)、染色體斷裂和Ames實(shí)驗(yàn)，但是這些方法都是在大量煩瑣試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，且花費(fèi)高，不利于廣泛采用[1]。彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）又稱為單細(xì)胞凝膠電泳（Single cellgel elelectrophoresis，SCGE），最早由Ostling等[2]提出。彗星實(shí)驗(yàn)可以定量檢測(cè)真核細(xì)胞中的多種DNA損傷，如單、雙鏈斷裂，堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)，不完全切除修復(fù)位點(diǎn)和DNA交聯(lián)等[3]。在之前的研究中，彗星實(shí)驗(yàn)多是利用動(dòng)物細(xì)胞DNA的損傷檢測(cè)環(huán)境污染物質(zhì)的致突變性和基因毒性，直到1996年Koppen等[4]第一次報(bào)道了利用植物為材料進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)環(huán)境污染物質(zhì)對(duì)基因的損傷。此后不斷有人利用植物彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)行環(huán)境致突變物的檢測(cè)[5]，表明植物彗星實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)一樣可靠，提供了環(huán)境污染檢測(cè)的一種手段，但是對(duì)疊氮鈉遺傳損傷研究以微核居多，尚未有文獻(xiàn)應(yīng)用疊氮鈉進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)研究其毒性。本研究以小麥（Triticum aestivum Linn.）為材料，應(yīng)用植物彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)初步研究了疊氮鈉對(duì)小麥葉片細(xì)胞DNA的損傷，以期為慧星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用于植物基因毒性檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 小麥品種由南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥品 疊氮鈉（NaN3）、無(wú)水乙醇、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）、溴化乙錠（EB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亞砜（DMSO）、正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMA）、TrtionX-100、纖維素酶、果膠酶、去離子水等。

1.1.3 主要儀器 Nikon熒光顯微鏡（中英昆蟲(chóng)生物學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室提供）、DYY-8C電泳儀、單面磨砂載玻片、蓋玻片（24 mm×50 mm）、移液槍及槍頭（各種規(guī)格）、離心管（各種規(guī)格）、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、玻璃培養(yǎng)皿、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、容量瓶、剪刀、紗布、濾紙、冰箱、吹風(fēng)機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片的處理和細(xì)胞核分離 采用去離子水無(wú)污染基質(zhì)培養(yǎng)的小麥葉片，將其下端浸入濃度0（CK，用0.1 mol/L、PH 6.8的磷酸緩沖液浸泡）、100、500、1 000、2 000 mg/mL的NaN3溶液，于黑暗中25 ℃下處理4 h或過(guò)夜。處理結(jié)束后，取出葉片置于已在冰上預(yù)冷的無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿中。為避免光線對(duì)結(jié)果的影響，所有操作均在暗光或紅光燈下進(jìn)行。葉片冷凍10 min后采用機(jī)械分離的方法獲得細(xì)胞核[6，7]，向培養(yǎng)皿加入一定體積的磷酸緩沖液，用無(wú)菌刀片在該緩沖液中輕輕將小麥葉片順葉脈切開(kāi)并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，收集沖洗液于無(wú)菌的1.5 mL離心管中，加入2%纖維素酶和果膠酶溶液在55～65 ℃下反應(yīng)約5 min，使葉片細(xì)胞核進(jìn)入緩沖液獲得細(xì)胞核懸液[8]。

1.2.2 電泳膠板制作 大多數(shù)實(shí)驗(yàn)常用“三明治”型3層凝膠結(jié)構(gòu)，但有文獻(xiàn)指出3層凝膠結(jié)構(gòu)容易脫落[9]，經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用2層凝膠結(jié)構(gòu)。第一層為正常熔點(diǎn)的瓊脂糖，第二層是低熔點(diǎn)瓊脂糖和細(xì)胞核懸浮液的混合層。先制備第一層瓊脂糖，將用95%乙醇浸泡過(guò)夜的單面磨砂載玻片干燥后水平放于濾紙上，用移液槍及預(yù)熱至85 ℃的無(wú)菌槍頭取預(yù)熱至65～75 ℃的濃度為0.65%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖100 μL于載玻片上，迅速蓋上潔凈的蓋玻片使其凝固，以獲得黏附力強(qiáng)、均勻一致的瓊脂糖層[10]。第一層瓊脂糖準(zhǔn)備好以后，將其放入4 ℃冰箱中預(yù)冷，待其凝固后取下蓋玻片。取小麥葉片細(xì)胞核的懸浮液與預(yù)熱至37 ℃的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖按1∶3（V/V，總體積為100 μL）混合均勻，滴在上述準(zhǔn)備好的載玻片上，迅速蓋上潔凈的蓋玻片，再放置到4 ℃下使其凝固。

1.2.3 細(xì)胞裂解 小心移去蓋玻片，用吹風(fēng)機(jī)小心垂直輕吹膠板平面，使殘余水分蒸發(fā)除去，以免裂解時(shí)膠面脫落。將載玻片置于無(wú)菌平皿中，輕輕加入預(yù)冷的新配制的細(xì)胞裂解混合液（pH>13）浸沒(méi)玻片，在常溫下裂解1 h或過(guò)夜[11]。小心取出載玻片，用去離子水輕輕漂洗2～3次，動(dòng)作要求輕柔，以免膠面脫落。

1.2.4 DNA解旋 將載玻片置于水平電泳槽陽(yáng)極端，并列放置，不留空隙。倒入新配制堿性電泳緩沖液覆過(guò)載玻片0.25 cm，放置20 min，使DNA變性解旋和產(chǎn)生，使DNA斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。

1.2.5 電泳 變性結(jié)束后在穩(wěn)壓35 V、200 mA下電泳30 min。

1.2.6 中和 電泳結(jié)束后取出玻片用去離子水沖洗3次，并用濾紙吸去多余的水分，放入無(wú)菌小玻璃培養(yǎng)皿，沿皿壁加入Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，將載玻片淹沒(méi)15 min，再將Tris-HCl吸去，用濾紙將皿內(nèi)液體吸干再緩緩加入無(wú)水乙醇，將載玻片浸埋1 h，吸去乙醇，晾干或室溫下過(guò)夜。

1.2.7 染色與觀察分析 每個(gè)載玻片加入30 mg/mL的溴化乙錠溶液50 μL染色20 min后，用Nikon 熒光顯微鏡在綠激發(fā)光下觀察，用隨機(jī)軟件在自動(dòng)曝光條件下用冷CCD拍照并獲取彗星圖像[12]，每張載玻片觀察25個(gè)細(xì)胞，一個(gè)處理做4張玻片，一個(gè)處理共計(jì)觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)下拖尾細(xì)胞數(shù)，求出細(xì)胞拖尾率，以X2檢驗(yàn)其顯著性，同時(shí)用CASP軟件分析各組平均尾長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)差，以t檢驗(yàn)檢測(cè)其顯著性，分析評(píng)價(jià)DNA的損傷程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度疊氮鈉溶液處理的小麥葉片彗星圖

不同濃度疊氮鈉溶液對(duì)小麥葉片DNA損傷結(jié)果如圖1所示。圖1A為對(duì)照，葉片細(xì)胞DNA基本上未發(fā)生損傷，在熒光顯微鏡下觀察，只有一個(gè)圓形的熒光頭，沒(méi)有拖尾；圖1B至圖1E為不同濃度疊氮鈉溶液處理后的彗星圖，發(fā)生了不同程度的拖尾，但因放大倍數(shù)過(guò)小圖像不甚清晰。從圖1可以看出，隨著疊氮鈉溶液的濃度逐漸增大，DNA受損也愈重，產(chǎn)生的斷鏈或斷片就愈多，其斷鏈或斷片也就愈小，在電場(chǎng)作用下遷移的DNA量愈多，遷移的距離愈長(zhǎng)，表現(xiàn)為彗星尾長(zhǎng)增加和彗星尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.2 不同濃度疊氮鈉溶液處理的小麥葉片細(xì)胞DNA遷移效應(yīng)

CASP軟件分析測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，濃度為100～2 000 mg/mL的疊氮鈉溶液處理的細(xì)胞出現(xiàn)較多拖尾，拖尾率高，各處理與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平。對(duì)照有7.3%細(xì)胞有拖尾現(xiàn)象，在理想條件下，對(duì)照細(xì)胞不發(fā)生拖尾現(xiàn)象，但細(xì)胞本身的狀態(tài)，以及操作中的一些細(xì)微損傷都可造成部分細(xì)胞發(fā)生拖尾，只要對(duì)照組細(xì)胞和處理組細(xì)胞其他處理?xiàng)l件相同，這些誤差可忽略不計(jì)，即對(duì)照細(xì)胞發(fā)生拖尾在彗星實(shí)驗(yàn)允許范圍之內(nèi)[13]。彗星尾長(zhǎng)隨疊氮鈉溶液濃度的增大明顯增長(zhǎng)，說(shuō)明疊氮鈉溶液劑量越大對(duì)葉片細(xì)胞DNA的損傷越嚴(yán)重，各處理與陰性對(duì)照差異均達(dá)極顯著水平（表1）。進(jìn)一步對(duì)疊氮鈉濃度（x）與彗星尾長(zhǎng)（y）的關(guān)系進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)曲線擬合，二者符合有截距的線性模型（圖2）：y=0.168 5x+152.8，R2=0.780 8，說(shuō)明疊氮鈉對(duì)葉片細(xì)胞DNA損傷存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

以上結(jié)果表明，疊氮鈉毒性與小麥細(xì)胞DNA損傷存在線性關(guān)系，具有明顯的遺傳損傷毒性，彗星實(shí)驗(yàn)可以利用植物細(xì)胞快速檢測(cè)環(huán)境中對(duì)遺傳物質(zhì)有毒性的物質(zhì)，是一種快速、簡(jiǎn)單、直接檢測(cè)DNA損傷的手段。

林愛(ài)軍等[5]利用彗星實(shí)驗(yàn)研究鎘對(duì)小麥葉片的DNA傷害，初步建立了植物彗星實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，得到了較好的結(jié)果。本研究利用疊氮鈉建立植物彗星實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，由于實(shí)驗(yàn)條件的差異，彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)各種條件的變化比較敏感，各種處理?xiàng)l件的變化直接影響實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)參數(shù)有待進(jìn)一步優(yōu)化。

采用的材料小麥?zhǔn)鞘澜缟峡偖a(chǎn)量第二的糧食作物，也是我國(guó)主要的糧食作物之一，其質(zhì)量和產(chǎn)量對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義，小麥的良種選育也是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要問(wèn)題。在遺傳良種引種工作中，對(duì)引種環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是一項(xiàng)很重要的工作，環(huán)境條件直接限制良種遺傳性狀的表達(dá)，而彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境細(xì)微DNA損傷比較敏感，為我們進(jìn)行環(huán)境檢測(cè)評(píng)估提供了一種可靠而簡(jiǎn)便快速的方法。

植物細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果外推于人類時(shí)，由于植物細(xì)胞與人類細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生化代謝各方面差距甚遠(yuǎn)，誘變劑進(jìn)入靶分子的方式及作用機(jī)理不甚相同，因此實(shí)驗(yàn)研究還有待于結(jié)合相應(yīng)的病理學(xué)調(diào)查。但是彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有特殊優(yōu)點(diǎn)有著廣泛的應(yīng)用前景，并且實(shí)驗(yàn)所用材料屬于真核生物，更能直接推測(cè)誘變物質(zhì)對(duì)人類或其他高等生物的遺傳危害，是一種比較理想的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)方法。

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