腫瘤壞死因子— α拮抗劑對(duì)椎間盤基質(zhì)代謝的影響

陶奇昌 陸軍 李強(qiáng)

【摘 要】目的：建立兔椎間盤退行性變動(dòng)物模型，探討腫瘤壞死因子-α拮抗劑（TNF-α Ra）對(duì)存在退行性變的兔椎間盤基質(zhì)代謝的影響。方法：建立兔椎間盤退行性變動(dòng)物模型，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組9只，試驗(yàn)組從造模2周腹腔注射TNF-α拮抗劑（417 ug/kg），隔4天重復(fù)注射至處死，對(duì)照組9只不予任何處理。于造模后1、2、3個(gè)月每組分別處死3只大白兔，完整取出腰3/4椎間盤固定、切片，予SABC法進(jìn)行免疫組化，并使用圖像分析系統(tǒng)對(duì)纖維環(huán)中Ⅱ型膠原染色進(jìn)行灰度值掃描，同理取出腰5/6椎間盤，使用間苯三酚法測(cè)量蛋白多糖含量。結(jié)果：術(shù)后第一個(gè)月試驗(yàn)組與對(duì)照組椎間盤髓核中Ⅱ型膠原灰度值及蛋白多糖含量無顯著性差異（P>0.05），第二個(gè)月及第三個(gè)月試驗(yàn)組與對(duì)照組Ⅱ型膠原染色的灰度值及蛋白多糖含量相比有非常顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論：TNF-α拮抗劑對(duì)存在退行性變的兔椎間盤基質(zhì)代謝有明顯的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】椎間盤；退行性變；免疫組化；間苯三酚；腫瘤壞死因子-α拮抗劑

椎間盤的退行性變是引發(fā)下腰痛的主要原因之一[1]。目前治療方案主要是對(duì)于有明顯癥狀、椎間盤退行性變晚期的患者行手術(shù)治療[2] 。TNF-α是重要的炎性細(xì)胞因子之一，有研究表明軟骨細(xì)胞能產(chǎn)生這種細(xì)胞因子，并能促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）和膠原酶參與退行性骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病[3，4]。本研究使用TNF-α拮抗劑對(duì)存在早期退變的兔椎間盤進(jìn)行干預(yù)，觀察TNF-α拮抗劑對(duì)兔腰椎間盤膠原代謝的影響及蛋白多糖的變化，并觀察其組織學(xué)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 健康4月齡雄性新西蘭大白兔18只，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供；注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白（益賽普），購自上海中信國健藥業(yè)有限公司；免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司；SABC試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；間苯三酚購自南京恒生制藥有限公司；日本OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及分組 椎間盤退變模型的建立參考如下方法[5]：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12h禁食， 3%戊巴比妥鈉溶液（1mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，右側(cè)臥位，透視定位腰3/4平面[ 6]，將腹內(nèi)臟器側(cè)移，透視針尖位于椎間隙平面，進(jìn)行穿刺。穿刺部位消毒包扎，于耳緣靜脈滴注青霉素40×104U。動(dòng)物蘇醒后放回兔籠，肌注青霉素40×104U，1次/天，連續(xù)注射3天。隨機(jī)取9只大白兔做試驗(yàn)組，隔4天腹腔注射益賽普（417ug/kg體重），分別于術(shù)后1月、2月、3月時(shí)各處死3只大白兔，動(dòng)物處死后立即取出腰椎，立即用蒸餾水沖洗三遍后置入10%中性福爾馬林緩沖液中固定24h，常規(guī)EDTA脫鈣、石蠟包埋，沿椎間盤正中水平面向上下按5μm厚度連續(xù)切片共10張，其中5張玻片留作Ⅱ型膠原免疫組化（髓核），另一側(cè)5張留作其他試驗(yàn)使用。對(duì)照組共9只不予任何處理。試驗(yàn)過程中標(biāo)本處理及檢測(cè)等各實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格保持一致。按上述方法取腰5/6椎間盤置入超低溫冰箱中集中檢測(cè)蛋白多糖。

1.2.2 免疫組化法 常規(guī)制備石蠟切片，蒸餾水與30%雙氧水按體積10：1混合，室溫下滴入組織，等待10min。蒸餾水沖洗3次，復(fù)合修復(fù)液修復(fù)10min，水洗3次，滴加5%牛血清白蛋白 室溫封閉20min，滴加濃度為2% 兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃過夜。磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG37℃放置20min，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物試劑置于37℃ 20min，DAB顯色，以肉眼觀察組織顯色，當(dāng)組織顯色為咖啡色時(shí)即自來水沖洗。.以蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。陽性部位都是細(xì)

胞外基質(zhì)。每批試驗(yàn)都隨機(jī)抽1張做為陰性對(duì)照，即將1抗換成磷酸鹽緩沖液 ，其余步驟同前。切片使用Simple PCI圖象分析軟件對(duì)髓核中Ⅱ型膠原的含量進(jìn)行分析。將灰度值閾值調(diào)成0-255，灰度值越高，則表明膠原的含量越低，測(cè)得灰度值作為膠原的相對(duì)含量。

1.2.3 蛋白多糖測(cè)定 取出椎間盤組織置于離心管中，加入3%NaOH0.5ml置入恒溫振蕩器中振蕩3h，保持溫度在40℃。加入鹽酸約2ml，把溶液pH值調(diào)至8～9，加入100mg/ml胰蛋白酶50μl酶解2h。.將溶液以間苯三酚法[7]測(cè)定蛋白多糖的含量，結(jié)果以mg/100mg濕重表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 12.0，所有數(shù)據(jù)均采用 s表示，各組間比較運(yùn)用t檢驗(yàn)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)月試驗(yàn)組與對(duì)照組髓核中Ⅱ型膠原免疫組化染色灰度值相似，隨著試驗(yàn)時(shí)間增加，試驗(yàn)組較對(duì)照組髓核中Ⅱ型膠原免疫組化染色灰度值低，具體各組大白兔Ⅱ型膠原免疫組化染色的灰度值見表1。

2.2 蛋白多糖測(cè)定結(jié)果 第一個(gè)月時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組蛋白多糖含量相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著試驗(yàn)時(shí)間增加，對(duì)照組大白兔椎間盤蛋白多糖的含量明顯下降，第二月及第三月時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比P<0.01。具體數(shù)據(jù)見表2。

3 討論

椎間盤中的蛋白多糖是由核心蛋白與數(shù)目不等的糖胺多糖（glycosaminog lycan， GAG）鏈通過共價(jià)鍵連接而形成的生物大分子。蛋白多糖的代表蛋白聚糖（aggrecan）被進(jìn)行廣泛深入的研究。蛋白聚糖中的糖胺多糖主要是硫酸軟骨素（CS）、透明質(zhì)酸（HA）和硫酸角質(zhì)素（KS）。GAG含量的改變能可靠的反映PG的變化[8]。在椎間盤退變的早期，蛋白多糖就可出現(xiàn)改變，而且其可以反映椎間盤退變的程度[9]。退變椎間盤中蛋白多糖含量下降同時(shí)其性質(zhì)發(fā)生改變，伴隨基質(zhì)中水分的丟失，導(dǎo)致椎間盤基質(zhì)的固定電荷密度和水合狀態(tài)改變，從而引起椎間盤生物力學(xué)的改變，加劇椎間盤退變。

Takahashi N等研究發(fā)現(xiàn)，突出的椎間盤細(xì)胞可合成和分泌TNF-α、白介素-1（IL-1）、PGE2等多種炎性介質(zhì)[10]。腫瘤壞死因子可以誘導(dǎo)炎癥因子如IL-1的產(chǎn)生，，而大量試驗(yàn)表明IL-1可以通過一氧化氮（NO）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等多種途徑參與降解椎間盤基質(zhì)，從而加速椎間盤退變。注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白是人Ⅱ型腫瘤壞死因子（TNF）受體p75的膜外區(qū)與IgG的Fc段構(gòu)建的融合蛋白，可特異性的阻斷TNF-α與其細(xì)胞表面受體的相互作用，從而 抑制IL-1對(duì)基質(zhì)中膠原的降解，延緩甚至阻止椎間盤的退變。

國內(nèi)外已有報(bào)道將TNF-α拮抗劑應(yīng)用于動(dòng)物及人體，但將其應(yīng)用于椎間盤退行性變動(dòng)物模型尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在第一個(gè)月試驗(yàn)組大白兔椎間盤髓核中Ⅱ型膠原染色的灰度值及髓核中蛋白多糖含量無明顯變化，可能原因?yàn)楦深A(yù)過早[5]，椎間盤尚未發(fā)生明顯退變有關(guān)。第二個(gè)月及第三個(gè)月時(shí)試驗(yàn)組及對(duì)照組髓核中Ⅱ型膠原灰度值及蛋白多糖的含量有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示TNF-α拮抗劑能較強(qiáng)的抑制椎間盤膠原及蛋白多糖的降解，對(duì)椎間盤的退變有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬瑞.腰椎間盤退行性疾病患者M(jìn)odic改變與性別、年齡、勞動(dòng)量、體重及下腰痛的關(guān)系[J].山東大學(xué) 2012：34-37.

[2] Gibson JN，Waddell G. Surgery for degenerative lumbar spondylosis： updated Cochrane Review[J]. Spine，30（20）：2312-2320

[3] 談志龍，邢國勝，李德達(dá)，等. 細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作用的研究[J]. 骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2003，18（5）：316-318.

[4] Goldring Mary B，Berenbaum Francis M D. The Regulation of Chondrocyte Function by Proinflammatory Mediators：Prostaglandins and Nitric Oxide [J]. Clini Orthop Relat Res， 2004，10（427）：37-44.

[5] 萬中元，李放，李進(jìn)珍，等. 經(jīng)皮纖維環(huán)穿刺法建立兔椎間盤退行性變動(dòng)物模型[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（15）：2699-2702.

[6] 王鵬，徐海孺，駱國鋼，等. 經(jīng)皮穿刺纖維環(huán)法誘導(dǎo)兔腰椎間盤退變模型[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19（11）：668-670.

[7] 魏涯，趙永強(qiáng)，郝淑賢，等. 咔唑法與間苯三酚法測(cè)定硫酸軟骨素比較研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，2012，8（6）：：65-71

[8] Urban MR，F(xiàn)airbank JC， Bibby， SR. Intervertebral disc composition Nueromuscular Scolosis： Changes in Cell Density and Glycosaminoglycan Concentration at the Curve Apex[J]. Spine.2001 Mar 15：26（6）：610-617

[9] 張振興，徐振華，牛光峰，等. 退變前后兔腰椎間盤細(xì)胞凋亡及蛋白多糖的比較[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（2）：169-171.

[10] Takahashi N，Kikuchi S，Shubayev VI， et al.TNF-alpha and phosphorylation of ERK in DRG and spinal cord：insinghts into mechanisms of sciatical[J].Spine，2006，31（5）：523-529.