苜蓿除草劑生物降解的微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制

穆丹等

摘 要：苜蓿田長殘留除草劑的大量應(yīng)用，對于后茬作物危害嚴(yán)重，進(jìn)行苜蓿田根圈土壤長殘留除草劑生物降解的研究意義深遠(yuǎn)。本試驗(yàn)對肇東苜蓿田根圈除草劑生物降解過程中微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組分和配制方法進(jìn)行研究，以期為開展苜蓿田長殘留除草劑生物降解菌活性成分的提取及應(yīng)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：除草劑；生物降解；微生物；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

中圖分類號 S476+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）08-13-02

苜蓿以“牧草之王”著稱，不僅產(chǎn)量高，且草質(zhì)優(yōu)良。肇東苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhaodong）為苜蓿屬的優(yōu)良牧草，是20世紀(jì)30年代由外地引種到黑龍江省肇東縣軍馬場的紫花苜蓿，在當(dāng)?shù)卦耘喽嗄?，后定名為肇東苜蓿，迄今已有80多年的栽培歷史[1]。肇東苜蓿植株多為直立，花紫色，顏色有深有淺，葉片大小與葉形不整齊[2]。該品種抗寒性強(qiáng)，無雪或少雪的半干旱地區(qū)，在-33℃的低溫下仍可露地越冬。在有雪覆蓋的大小興安嶺嚴(yán)寒地區(qū)，-45℃尚可安全越冬。其豐產(chǎn)性能好，干草產(chǎn)量6.75～10.5t/hm2；適應(yīng)區(qū)域廣，宜植區(qū)為東北北部、內(nèi)蒙古東部、新疆、甘肅等地[3]。

由于苜蓿田種植面積的不斷擴(kuò)大和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，為提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，有效防治病、蟲、草害，越來越多的長殘留除草劑應(yīng)用于苜蓿田。自20世紀(jì)80年代以來，磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的使用面積迅速擴(kuò)大[4]。至20世紀(jì)90年代末期，黑龍江省長殘留除草劑年銷售量（制劑）為：氯嘧磺隆60～70t，咪唑乙煙酸800～1000t，異噁草酮200～300t，氯磺隆20～30t，阿特拉津600～700t[5-6]。長殘留除草劑以前所未有的速度進(jìn)一步發(fā)展， 特別是氯嘧磺隆與咪唑乙煙酸已成為苜蓿田難以取代的化學(xué)藥劑。這種現(xiàn)象將導(dǎo)致后茬敏感作物受害頻繁發(fā)生，造成苜蓿田減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。面對此種局面，對于苜蓿田根圈土壤長殘留除草劑生物降解的研究勢在必行且意義重大。本試驗(yàn)擬對肇東苜蓿田根圈除草劑生物降解過程的微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組分和配制方法進(jìn)行研究，以期為開展苜蓿田長殘留除草劑生物降解菌活性成分的提取及應(yīng)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)的材料如下：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、蒸餾水、淀粉、KH2PO4、MgSO4、KNO3、FeSO4、KNO3、FeSO4·7H2O、K2HPO4等。

1.2 設(shè)備 HS-1300-U型水平循環(huán)潔凈凈化工作臺（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）、HZQ-C型雙層恒溫?fù)u床（金壇市順華儀器有限公司）、干燥箱、電磁爐、高壓滅菌鍋、分析天平、722型分光光度計(jì)、pH計(jì)等。

2 土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成與配制方法

2.1 除草劑生物降解中的真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

2.1.1 真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成 馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來分離真菌的選擇性培養(yǎng)基，由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉紅（玫瑰紅，Rose Bengal）及鏈霉素等組成，具體成分見表1。

2.1.2 真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制方法 （1）稱量和溶化：按照培養(yǎng)基的配方，準(zhǔn)確稱取KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、蛋白胨，并將各成分依次溶于少許蒸餾水中。將孟加拉紅配成1%的溶液，量取1%孟加拉紅溶液3.3mL，加入培養(yǎng)液中，混勻后，加入16g瓊脂，加熱溶化。待各成分完全溶化后，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL。（2）將配制好的溶液分裝、加塞、包扎、高壓滅菌。滅菌冷卻后，4℃保存?zhèn)溆?。?）抗生素的配制：將鏈霉素配制成1%的溶液，濃度為100ug/mL。由于抗生素（鏈霉素）受熱容易分解，故臨用時(shí)，將培養(yǎng)基溶化后待溫度降至約45℃時(shí)才可加入。

2.2 除草劑生物降解中的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

2.2.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成 牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基是用來分離細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基，也是一種應(yīng)用十分廣泛的天然培養(yǎng)基，由牛肉膏、蛋白胨及NaCl等成分組成，具體成分見表2。其中，牛肉膏可為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，NaCl可為微生物提供無機(jī)鹽。

2.2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制方法 （1）稱量和溶化：按照培養(yǎng)基的配方，準(zhǔn)確稱取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，并將各成分依次加入少許蒸餾水中，用玻璃棒攪勻，將燒杯置于火上加熱。待各組分溶解后，加入瓊脂2g，不斷攪拌，以免粘底。瓊脂完全溶解后，補(bǔ)足蒸餾水至100mL。（2）調(diào)pH值：先用精密pH試紙測量培養(yǎng)液的pH值，如pH值偏酸，則用滴管向培養(yǎng)液中逐滴加入1mol/L的NaOH，邊加邊攪拌，直至pH值達(dá)7.0～7.2。如pH值偏堿性，則用1mol/L的HCl。注意pH值不應(yīng)調(diào)過頭，以免回調(diào)，否則將影響培養(yǎng)液中各離子的濃度。（3）將配制好的溶液分裝、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20min。滅菌冷卻后，置于37℃溫室中培養(yǎng)24～48h，檢查滅菌是否徹底。

2.3 除草劑生物降解中的放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

2.3.1 放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成 放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基，是用來培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。如果加入適量的抗菌藥物，則可用來分離各種放線菌。其主要成分包括KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、瓊脂、可溶性淀粉以及蒸餾水等，具體成分見表3。

2.3.2 放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制方法 （1）稱量和溶化：按照培養(yǎng)基的配方，先稱取可溶性淀粉2g，將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少許沸水，置于火上加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后，準(zhǔn)確稱取KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、瓊脂以及FeSO4·7H2O（微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液，按比例換算后加入）。待各組分完全溶解后，補(bǔ)足蒸餾水至100mL。（2）調(diào)PH值：先用精密pH試紙測量培養(yǎng)液的pH值，如PH值偏酸，則用滴管向培養(yǎng)液中逐滴加入1mol/L的NaOH，邊加邊攪拌，直至pH值達(dá)7.2～7.4。如pH值偏堿性，則用1mol/L的HCl。注意pH值不應(yīng)調(diào)過頭，以免回調(diào)，否則將影響培養(yǎng)液中各離子的濃度。（3）將配制好的溶液分裝、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20min。滅菌冷卻后，置于37℃溫室中培養(yǎng)24～48h，檢查滅菌是否徹底。

此合成培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有多種化學(xué)成分已知的無機(jī)鹽，這些無機(jī)鹽可能相互作用產(chǎn)生沉淀。因此，混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時(shí)還需要將兩種或多種成分分別滅菌，使用時(shí)再按比例混合。

3 結(jié)果與討論

試驗(yàn)對于肇東苜蓿田根圈土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制進(jìn)行了探討，包括真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基以及放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組分和具體的配制方法研究。通過本試驗(yàn)的研究，為長殘留除草劑生物降解中土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制提供了可靠的組分和技術(shù)方法。同時(shí)，肇東苜蓿田除草劑生物降解中土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制的研究成果擬在生產(chǎn)上進(jìn)行應(yīng)用，將具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和深遠(yuǎn)的意義，也將為開展苜蓿田長殘留除草劑生物降解菌活性成分的提取及應(yīng)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

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