酶聯(lián)免疫斑點試驗在快速診斷結(jié)核桿菌感染性疾病中的應用價值

章士清等

【摘 要】目的：探討酶聯(lián)免疫斑點檢測技術(shù)（ELISPOT）（T-SPOT.TB）在快速診斷結(jié)核桿菌感染性疾病中的臨床應用價值。方法：利用ELISPOT檢測對結(jié)核菌特異抗原刺激反應，分泌γ-干擾素的效應T淋巴細胞數(shù)量方法，對72例結(jié)核桿菌感染性疾病組和20例健康體檢者組的外周血作能分泌結(jié)核特異的γ-干擾素的T淋巴細胞測定，與結(jié)核菌純蛋白衍生物試驗（ PPD） 、結(jié)核抗體檢查結(jié)果進行比較分析。結(jié)果：T-SPOT.TB敏感性為 91.7%，較PPD試驗36.1%、抗結(jié)核抗體55.6%和PPD試驗+抗結(jié)核抗體29.2%均明顯增高，P值均< 0. 01，在統(tǒng)計學上具有顯著差異。T-SPOT.TB特異性為 95. 0%。較PPD試驗（85%）、PPD試驗+抗結(jié)核抗體（90%）差異無統(tǒng)計學意義（P值均>0.05），而較之結(jié)核抗體的特異性 60.0%，在統(tǒng)計學上也具有顯著差異（P < 0. 01）。T-SPOT.TB的準確率為 92.4%，較PPD試驗46.7%、抗結(jié)核抗體56.5%和PPD試驗+抗結(jié)核抗體42.4%均明顯增高，P值均< 0. 01，在統(tǒng)計學上具有顯著差異。結(jié)論：酶聯(lián)免疫斑點試驗驗檢測結(jié)核敏感性強、準確率高，是診斷結(jié)核感染的有效手段。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；T-SPOT.TB；PPD試驗 抗結(jié)核抗體

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，是目前嚴重威脅人類健康的三大感染性疾病之一， 快速診斷和治療是結(jié)核病控制的關(guān)鍵問題，但是，結(jié)核病的診斷仍然存在嚴重問題。傳統(tǒng)的結(jié)核病檢測方法如痰涂片染色法、培養(yǎng)法、免疫學方法和分子生物學方法等等雖然很多，但是這些方法存在敏感性較低、特異性較差、操作復雜，檢測周期長等問題。酶聯(lián)免疫斑點試驗（enzyme-linked immunos pot， ELISPOT） （T-SPOT.TB）是由Czerkinsky等[1]于1983年根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA）建立的一種體外檢測單細胞水平特異性抗體分泌細胞功能的免疫學技術(shù)，并由La-lvani等[2]首先將其應用于結(jié)核病的快速診斷，為結(jié)核病的快速診斷提供了一條新途徑。本研究旨在以T-SPOT.TB檢測其外周血結(jié)核特異抗原T淋巴細胞的數(shù)量，探討該技術(shù)在結(jié)核病快速診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1病例資料 結(jié)核組： 72 例均為 2012 年 3 月～2013年3 月本院住院的結(jié)核患者，結(jié)核病診斷依據(jù)2001年中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會制定的結(jié)核病的診斷標準執(zhí)行，具有較高的可信性和可比性。男 44 例，女 28 例，年齡 16 ～78（ 39.6 ± 16.5.） 歲。其中肺結(jié)核 54 例，結(jié)核性胸膜炎 14 例，骨結(jié)核2例，結(jié)核性腦膜炎 1 例，腸結(jié)核 1例，所有病例均為臨床確診病例。健康對照組： 22 名本院體檢中心體檢健康人員，男 14 例，女 6 例，年齡12 ～ 46（ 28.5 ± 12. 0） 歲，均無結(jié)核病史和任何臨床癥狀，經(jīng)X 線檢查確定無異常。

1.2 T-SPOT.TB 取3～4mL外周抗凝血，用淋巴細胞分層液分離、提純外周血單個核細胞（PB-MC），調(diào)節(jié)細胞濃度至2.0×106/L。取一預包被IFN-C捕獲單克隆抗體的微孔板，每個測試樣本需要微孔板3孔：陰性對照孔內(nèi)加入完全細胞培養(yǎng)液50uL，陽性對照孔內(nèi)加入陽性對照PHA50uL；在測試孔內(nèi)分別加入CFP10-ESAT6融合蛋白50uL。分別在上述各孔內(nèi)加100uL含有2×105個PBMC的懸液，將微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20h；棄上清液，用200uL×PBS洗板4次，每孔加入50uL1∶60稀釋的IFN-γ檢測抗體，37℃孵育2h；洗板后，每孔加入50uL1：1 000稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶，室溫孵育2h；洗板后，每孔加入50uL新鮮配制的BICP/NBT底物，顯色15min；可見板底顯示紫色斑點，用蒸餾水洗板中止反應。每1個點代表1個分泌IFN-γ的T細胞，應用CTL公司酶聯(lián)斑點分析儀計數(shù)著色的斑點。當陰性對照孔點數(shù)<6，檢測孔點數(shù)減去陰性對照孔點數(shù)≧8，可判斷所檢測標本為陽性；如果陰性對照孔點數(shù)≧6，檢測孔點數(shù)為陰性對照孔2倍，可判斷所檢測標本為陽性。

1.3 PPD試驗：于左前臂皮內(nèi)注射標準PPD 0.1ml（含5個結(jié)核菌素單位）。72h查驗反應結(jié)果，記錄硬結(jié)平均直徑。按PPD皮試結(jié)果分級：PPD（-）：硬結(jié)<5mm；PPD（+）：硬結(jié)5～9mm；PPD（++）：硬結(jié)10～19mm；PPD強陽性（+ + +）：硬結(jié)≥20mm或出現(xiàn)明顯水泡、壞死。

1.4 抗結(jié)核抗體檢測 取外周不抗凝血2～3mL，1～2h后3 000r/min離心15min，取上清液用于抗結(jié)核抗體檢測。聯(lián)合檢測3個抗結(jié)核抗體所用抗原分別為阿拉伯甘露聚糖、結(jié)核分枝桿菌活動期產(chǎn)生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。嚴格按試劑盒提供的步驟操作。檢測的血或（和）痰及體液標本≧2。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用 SPSS 17. 0 軟件分析，采用χ2檢驗對各組檢出陽性率進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核組患者和健康對照組的結(jié)核相關(guān)檢查結(jié)果見表1

T-SPOT.TB的靈敏性91.7 %（66/72），PPD試驗的靈敏性為36.1%（26/72），抗結(jié)核抗體的靈敏性為55.6%（40/72），PPD試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢查的靈敏性為29.2%（21/72）， T-SPOT.TB的靈敏性較PPD試驗、抗結(jié)核抗體、PPD試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢查的靈敏度性均明顯增高，P均< 0. 01，具有顯著統(tǒng)計學差異。T-SPOT.TB的特異性95.0%（19/20），與PPD試驗的85.0%（17/20）和PPD試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢查的90.0%（18/20）相比，差異無統(tǒng)計學意義（P值均>0.05），但是較之抗結(jié)核抗體的特異性60.0%（12/20）有顯著統(tǒng)計學差異（P < 0. 01）。T-SPOT.TB的準確率92.4 %（85/92），PPD試驗的準確率為46.7%（43/92），抗結(jié)核抗體的準確率為56.5%（52/92），PPD試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢查的準確率為42.4%（39/92）， T-SPOT.TB的準確率較PPD試驗、抗結(jié)核抗體、PPD試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢查的準確率均明顯增高，P均< 0. 01，具有顯著統(tǒng)計學差異。

3 討論

T-SPOT·TB是以 T 細胞免疫應答為基礎的 γ-干擾素（ γ-IFN） 釋放實驗，其原理是結(jié)核桿菌感染者外周血單核細胞 （ PBMC） 中存在的特異性 T 細胞在受到抗原早期分泌性抗原靶蛋白 6（ ESAT-6） 和培養(yǎng)濾過蛋白 10 （ CFP-10） 刺激后會分泌 γ-IFN，釋放的 γ-IFN 隨即與微孔板底部包被的 γ-IFN 抗體結(jié)合而形成免疫復合物，該復合物再與隨后加入的堿性磷酸酶標記的抗抗體結(jié)合，繼而分解分解隨后加入的顯色底物溶液而在反應部位形成不溶性色素沉淀斑點。每一個斑點代表 1 個 γ-IFN 分泌細胞（ 結(jié)核特異的效應 T 細胞） 。根據(jù)斑點數(shù)推測體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應的效應 T 細胞，從而對結(jié)核桿菌感染進行輔助診斷[3]。其中抗原 ESAT-6 和 CFP-10 為結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌所特有，而不存在于卡介苗及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中[4]，因而從根本上避免了傳統(tǒng)結(jié)核菌素皮試中所存在的 BCG 交叉抗原反應，從而確保了 T-SPOT·TB 的高度特異性。

本研究對 92 例受檢者進行了 T-SPOT·TB 檢測，結(jié)果表明其診斷結(jié)核的特異性和敏感性分別為95. 0% 和 91.7% 。這與國內(nèi)外學者[5、6、7、8]的研究結(jié)果相似。而且整個檢測過程，僅需24 h。由于每份標本采用陰性、陽性對照，結(jié)果更加客觀可靠、操作簡便。通過使用儀器尚可實現(xiàn)自動化。說明ELISPOT法可快速檢測外周血中的結(jié)核菌抗原特異T淋巴細胞的反應頻率，對結(jié)核病的快速診斷提供可靠的客觀依據(jù)。

除了 T-SPOT·TB 檢測以外，本研究對 92 例受檢者還進行了 PPD 和結(jié)核抗體檢查，結(jié)果表明 T-SPOT·TB 診斷結(jié)核敏感性91.7%、準確率92.4%均顯著高于PPD 試驗、抗結(jié)核抗體和PPD 試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢驗方法，具有顯著統(tǒng)計學差異（P 均< 0. 01）。T-SPOT·TB的特異性水平95%這與國內(nèi)外多位學者[5，8]的研究結(jié)果一致。其優(yōu)于PPD試驗、PPD試驗+抗結(jié)核抗體聯(lián)合檢查，可能由于健康體檢組樣本量較少，無統(tǒng)計學差異（P值均>0.05）。但是顯著優(yōu)于抗結(jié)核抗體的60%水平（P < 0. 01）。我國是結(jié)核感染的高流行區(qū)，可能存在著相當比例的潛伏結(jié)核感染者，而且卡介苗接種率高，這就嚴重影響了抗結(jié)核抗體檢查和PPD試驗的臨床應用價值。而T-SPOT·TB不受卡介苗接種接種影響[2，5]，還可以有效地篩選出潛伏結(jié)核感染者，對這些潛伏感染患者進行干預治療可以有效遏制潛伏結(jié)核轉(zhuǎn)化為活動性結(jié)核，提高了它對結(jié)核病的診斷準確率，這些對于減少結(jié)核感染的傳播和流行，實現(xiàn)結(jié)核病疫情控制目標至關(guān)重要。 總而言之，本研究進一步肯定了T-SPOT.TB檢測在結(jié)核桿菌感染性疾病臨床診斷中的應用價值。它具有快速、準確的特點，較目前臨床常用的PPD試驗及抗結(jié)核抗體檢測有明顯的優(yōu)勢，值得進一步推廣和應用。

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