磷脂酶A2在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用

李飛燕 張日云 王娜 王明剛 毛德文

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（南寧 530200）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2肝病科，3科研部 （南寧 530023）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界癌癥相關(guān)死亡的第四大原因［1］。根據(jù)2020年全球癌癥人數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示［2］，全球每年大約有60 萬HCC的新發(fā)病例，HCC 的死亡人數(shù)在50 萬左右。而我國的新發(fā)病例就占據(jù)了全球的47%［3］。HCC的發(fā)病與肝臟持續(xù)的應(yīng)激源有關(guān)，主要是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染，病毒感染導(dǎo)致肝硬化及HCC。HCC 同時也是肝硬化患者死亡的主要原因［4］。全世界約有2.96 億人口感染HBV，其中，我國有8 600萬乙肝病毒攜帶者，3 200萬慢性乙型肝炎患者［5?6］。龐大的乙肝病毒感染基數(shù)，給HCC的發(fā)展帶來了潛在的風(fēng)險。從乙肝到HCC 主要經(jīng)歷三步：肝炎→肝硬化→HCC。HBV 進入機體后，機體通過免疫反應(yīng)清除病毒的同時，也導(dǎo)致肝細胞損傷，從而引發(fā)肝臟炎癥的發(fā)生。肝細胞損傷后進行自我修復(fù)，肝臟以瘢痕化、纖維化出現(xiàn)，使肝臟失去應(yīng)有的柔軟、彈性，質(zhì)地逐漸變硬，進而發(fā)展為肝硬化。HBV 與HCV 的主要治療手段有：疫苗接種、抗病毒治療［7］。盡管我國實施了疫苗接種計劃多年，在一定程度上減少HBV 和HCV 的感染，但由于人口眾多，HBV 和HCV 感染的絕對數(shù)量仍然很高。慢性乙型肝炎的最佳治療終點是乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）血清清除，即使進行了HBsAg 血清清除，也仍然存在轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC 的風(fēng)險［8］。

高發(fā)病率、高病死率、低生存率是HCC 在我國流行病學(xué)上呈現(xiàn)出的基本特征。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示［9］，HCC 患者預(yù)后差，5 年生存率僅13%左右。HCC 發(fā)病與吸煙、酒精、咖啡、飲食等因素有關(guān)［10］。HCC 生長受到多種因素影響，其中包括表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），這些生長因子通過細胞內(nèi)信號途徑促進血管生成和細胞增殖［11］。在過去的30 年里，隨著抗病毒治療的實施，雖然我國HBV 和HCV 引起的HCC 已經(jīng)有所下降，但是抑制病毒復(fù)制并不能根除病毒，因此HCC 的發(fā)展仍在持續(xù)進行中［12］。HCC 的治療方式為：手術(shù)治療、放射治療和免疫療法［13］。手術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險高，且多數(shù)患者在就診時已錯過最佳手術(shù)時機。免疫治療作為HCC 治療的一個重要方法，其在患者間療效有很大的差異，治療費用高，給臨床治療帶來了很大的挑戰(zhàn)［9］。因此，深入研究HCC 形成與發(fā)展的分子機制，尋找新的干預(yù)靶點或治療手段仍迫在眉睫。

新近研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）積極參與了HCC 形成與發(fā)展過程，其能催化磷脂sn?2位?；?。按酶的特性與結(jié)構(gòu)PLA2可以分為三大類：分泌型磷脂酶A2（secretory phos?pholipase，sPLA2）、胞質(zhì)型磷脂酶（cytosolipase，cPLA2）和鈣非依賴型（Ca2+?independent phospholi?phone，iPLA2）［14］。PLA2 廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，對許多細胞反應(yīng)起著重要的影響，并參與磷脂的消化代謝，免疫防御和信號傳導(dǎo)等一系列復(fù)雜的進程。激活PLA2 可產(chǎn)生花生四烯酸（arachi?donic acid，AA）級聯(lián)反應(yīng)，具有誘導(dǎo)肝癌細胞存活、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等一系列作用。PLA2與HCC 的發(fā)病有廣泛的關(guān)聯(lián)，故深入探討PLA2 發(fā)病中HCC 的病理機制有十分重要的意義。本文總結(jié)了PLA2 對HCC 進展的作用特點，以期為HCC藥物研發(fā)及臨床防治工作提供新思路及藥物靶點。

1 PLA2 的亞型及其功能特點

1.1 sPLA2 的特性及基本功能特點sPLA2 可切割sn?2 位上的酯鍵以產(chǎn)生溶血磷脂（lysophospho?lipid，LPL）和游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)A）。PLA2 中釋放出的脂肪酸包括單不飽和脂肪酸（mono?unsaturated fatty acids，MUFA）以及多不飽和脂肪酸類（poly?unsatulas，PUFA），例如AA，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic Acids，EPA）二十二碳六烯酸（docosahexaenoic，DHA）等，這些脂肪酸可進一步轉(zhuǎn)化成脂質(zhì)介質(zhì)中具有生物活性的脂質(zhì)代謝物并發(fā)揮激素樣分子信號作用［15］。sPLA2 根據(jù)其主要結(jié)構(gòu)被細分為Ⅰ型和Ⅱ型兩大類。ⅡA型分泌型磷脂酶A2（type ⅡA secreted phospholi?pase A2，sPLA2?ⅡA）能夠作用于內(nèi)源性底物，如線粒體和細胞外囊泡，并在炎癥或組織損傷期間從宿主細胞釋放。與宿主免疫其他分子一樣，sPLA2?ⅡA 具有雙向調(diào)節(jié)作用。在受到病原體感染時，sPLA2?ⅡA 比其他分子低的含量時就已經(jīng)可以起到抗菌作用。磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl?serine，PS）暴露可導(dǎo)致血栓前狀態(tài)，這一狀態(tài)往往與嚴重的炎癥誘導(dǎo)疾病相關(guān)。sPLA2 能有效地水解PS 暴露（凋亡）細胞，反過來又會在環(huán)境中釋放脂質(zhì)分解產(chǎn)物。與正常細胞相比，PS暴露膜在鈣依賴過程中被sPLA2 快速分解，不管觸發(fā)因素如何，升高sPLA2水平表明強烈的持續(xù)性炎癥信號［16］。研究顯示［17］，sPLA2 可通過引起腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）?α 生成，釋放細胞色素c而發(fā)揮其凋亡活性。以上證據(jù)說明，sPLA2 具有參與炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

1.2 cPLA2 的特性及基本功能特點除cPLA2γ外，所有cPLA2 酶的N 端均含有鈣依賴性脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，需要微摩爾水平鈣離子才能充分發(fā)揮酶活性［15］。對于cPLA2α 來說，在受到細胞外刺激下，cPLA2α 被激活，活化的cPLA2α 催化AA 從膜磷脂（membrane phospholipids，PLs）中釋放，進而導(dǎo)致脂質(zhì)介質(zhì)前列腺素（prostaglandins，PGs）、白三烯（leukotrienes，LTs）和血小板活化因子（platelet?activating factor，PAF）的產(chǎn)生。cPLA2γ 不含C2 結(jié)構(gòu)域，其活性不需要鈣離子，活化后的cPLA2γ 在C 末端附近法尼化，組成膜結(jié)合。這種非典型cPLA2 亞型通過iPLA2、溶血磷脂酶和轉(zhuǎn)酰酶（以CoA 非依賴方式將脂肪酸從一種磷脂轉(zhuǎn)移到另一種磷脂）活性參與PLs 重塑。cPLA2γ 的活性可能與肝細胞中的脂滴生成有關(guān)，因為它的敲除可減少HCV 病毒感染后的脂滴形成，而它的腺病毒過度表達促進了高脂飲食小鼠肝臟中脂滴形成和脂肪積累［18］。因此，cPLA2參與肝臟炎癥反應(yīng)。

1.3 iPLA2 的特性及基本功能特點iPLA2 是一種不依賴Ca2＋的酶［19］。iPLA2 主要是作為脂肪酶發(fā)揮作用。iPLA2β 是一種分子量約85 kDa 的細胞溶質(zhì)蛋白，其催化結(jié)構(gòu)域中有絲氨酸脂肪酶共有序列（GTSGT）。iPLA2β 主要通過生成LPL 受體，該受體結(jié)合脂肪酸參與PLs 維持［20］。iPLA2β 激活可產(chǎn)生多種具有生物活性的脂質(zhì)介質(zhì)有明顯促炎作用。iPLA2 γ 基因分布在染色體7q31 上，cDNA編碼含782 種氨基酸、分子量90 kDa 蛋白質(zhì)［20］。iPLA2γ 基因轉(zhuǎn)錄普遍存在。iPLA2γ 與iPLA2β 一樣，通過生成LPL 受體參與PLs 的維持。iPLA2γ與細胞的死亡有關(guān)，開啟線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細胞死亡的首要步驟。iPLA2γ定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體和過氧化物酶體中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)iPLA2β 參與細胞對氧化應(yīng)激的保護，iPLA2γ 的缺失會導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常。研究表明［21］，肝臟過氧化物酶體膜高度富集AA。iPLA2γ也參與脂質(zhì)介質(zhì)生成，通過線粒體Ca2+誘導(dǎo)iPLA2γ活化釋放AA 隨后被氧化形成多個下游類花生酸，如脂氧合酶產(chǎn)生的羥基二十四碳烯酸、環(huán)氧化酶（cyclooxygenases，COX）產(chǎn)生的PGs 和細胞色素P450s產(chǎn)生環(huán)氧二十碳三烯酸［22］。上述說明，iPLA2參與維持線粒體完整性、磷脂重塑、防治氧化應(yīng)激、脂質(zhì)介質(zhì)生物合成及細胞死亡［23］。

2 PLA2 與HCC

2.1 sPLA2與HCCsPLA2分子量大約在14 kDa，它需要亞毫摩爾至毫摩爾濃度Ca2＋激活，以在8.0～9.0最佳pH值下有效水解底物磷脂［24］。sPLA2水解細菌和病毒膜產(chǎn)生AA，進而釋放多種生物活性脂質(zhì)介質(zhì)，包括PGs、血栓素、LTs 和脂蛋白，這些分子具有強大多性效用，可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。AA作為一種PLA2代謝物，可介導(dǎo)健康和病理狀態(tài)下多種細胞機制，如血小板聚集、淋巴細胞活化和組織炎癥。AA 可以通過調(diào)節(jié)Ca2+選擇性通道激活Ca2+進入，從而減少細胞增殖和遷移，同時通過凋亡誘導(dǎo)細胞死亡，可起到抗腫瘤作用［25］。sPLA2通過核因子κB（nuclearfactor?kappa B，NF?κB）的激活對癌細胞增殖發(fā)揮作用，抑制sPLA2 可減弱癌細胞NF?κB 活性，減少細胞增殖并促進細胞凋亡。AA 能通過環(huán)氧合酶和5?脂氧合酶途徑進一步在細胞內(nèi)代謝并分別生成促炎介質(zhì)如PGs、LTs等，它們能激發(fā)TNF?α 和白細胞介素（interleukin，IL）?1 等炎癥細胞因子的產(chǎn)生增強sPLA2 自身表達，導(dǎo)致炎癥事件的信號放大和加劇。研究顯示［26］，炎癥性疾病、癌癥中存在高水平sPLA2 表達，局部和全身炎癥都與體內(nèi)sPLA2 的釋放有關(guān)，此外，IL?1β、IL?6 和TNF?α 等促炎因子在多種組織中誘導(dǎo)sPLA2 基因轉(zhuǎn)錄并隨后增加其分泌。炎癥因子TNF?α 和IL?1，還可以間接誘導(dǎo)人肝癌細胞和肝細胞中sPLA2?ⅡA 表達。在炎癥發(fā)作期間，人類肝癌細胞在對包括TNF?α、IL?1 和IL?6 在內(nèi)的各種趨化因子的反應(yīng)中釋放出sPLA2 ⅡA，sPLA2 ⅡA 的水平也與吞噬作用和中性粒細胞功能改變密切相關(guān)，即釋放超氧物、趨化性和溶酶體酶［27］。因此，sPLA2 參與HCC 發(fā)展進程中炎癥反應(yīng)、細胞增殖及調(diào)亡進程。

2.2 cPLA2與HCCcPLA2的分子量約在85 kDa［14］。cPLA2α 在細胞活化后，從核周膜室的磷脂中選擇性地釋放AA，AA 通過環(huán)氧合酶和末端PG 合成酶對PG的順序作用（COX途徑）或5?脂肪氧化酶和末端LT合成酶向LT的順序作用進行代謝［18］。在肝癌中，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF?β）通過p38 MAPK（mitogen activated protein kinases，MAPK）和ERK1/2 介導(dǎo)激活cPLA2α 磷酸化。研究表明［28］，肝癌細胞中cPLA2α 的過度表達可阻止TGF?β1 誘導(dǎo)生長抑制，cPLA2α 過度表達可阻止TGF?β1 誘導(dǎo)的Hep3B 細胞caspase?3 裂解，cPLA2a 在預(yù)防TGF?α 誘導(dǎo)凋亡中起作用。AA 分泌二十碳六烯酸通過自分泌作用激活G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein?coupled receptor，GPCR）介導(dǎo)的信號通路，促進TNF?α 轉(zhuǎn)錄、合成和釋放，進而誘導(dǎo)NF?κB 依賴性基因表達。此外，NF?κB 核移位可增強cPLA2 的表達；反過來，cPLA2 過度表達進一步增加AA 的釋放，并增強二十烷酸介導(dǎo)的促腫瘤作用（癌細胞存活、增殖、凋亡抵抗、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移）［29］。PGE2屬于PG，主要是通過它分別以自分泌或者旁分泌機制作用于EC 表面或者腫瘤細胞上，GPCR中E?PGs 2/4亞型而激發(fā)VEGF。TGF?β 是肝臟生理病理的關(guān)鍵調(diào)控因子，它參與肝臟疾病從肝炎、肝纖維化到肝硬化和HCC 的發(fā)展過程。在HCC 中，TGF?β 激活cPLA2α 磷酸化，一方面導(dǎo)致AA 產(chǎn)生PGE2 并促進細胞生長，另一方面激活過氧化物酶體增殖物激活受體?γ（peroxisome prolif?erator?activated receptor?γ，PPAR?γ），從而抵消smad 2/3 依賴性TGF?β 信號通路介導(dǎo)的細胞增殖抑制［29］。因此，激活cPLA2 能促進HCC 進展。

2.3 iPLA2 與HCCiPLA2 分子量范圍在28～146 kDa［19］。iPLA2β 蛋白含有1 個caspase 3 裂解位點（DVTD）和一個假定雙核定位序列（KREF?GEHTKMTDVKKPK），并且該蛋白在受到刺激后，可以與多個亞細胞定位蛋白結(jié)合，并動員到高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）、線粒體和細胞核等亞細胞器。ER 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，稱為蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)就是對細胞器及細胞外空間中蛋白質(zhì)生物的發(fā)生，折疊，裝配，轉(zhuǎn)運等過程進行監(jiān)控［30］。出現(xiàn)缺氧、未折疊蛋白聚集、能量匱乏和其他刺激因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［31］。ER 應(yīng)激可導(dǎo)致細胞存活、凋亡、增殖及分化，ER應(yīng)激與許炎癥疾病、癌癥等疾病相關(guān)［30］。研究［32］表明，iPLA2β 的增加會強化ER 應(yīng)激并增強細胞凋亡，通過抑制iPLA2β 可改善ER 應(yīng)激并減少細胞死亡。iPLA2β 在C 端半部包含脂肪酶共有序列Gly?X?Ser?X?Gly，以及圍繞該基序的幾個片段，與iPLA2β、cPLA2 和patatin 的催化結(jié)構(gòu)域同源。iPLA2β 包含8 個N 端錨蛋白重復(fù)序列、1 個ATP 結(jié)合盒（GGGVKG）、1 個caspase?3 裂解位點（DVDT）和2 個鈣調(diào)蛋白（CAM），iPLA2 β 激活可導(dǎo)致膜甘油磷脂中sn?2 脂肪酸替代基被水解產(chǎn)生游離脂肪酸，如AA、EPA、DHA 及2?LPL 等，AA 之后經(jīng)環(huán)氧合酶、脂氧合酶等通路被代謝掉，導(dǎo)致產(chǎn)生生物活性氧化類二十碳六烯酸，并被認為是炎癥疾病的促因。二十碳烯酸有助于炎癥和自身免疫疾?。?3］。AA 在環(huán)氧合酶、脂氧合酶的作用下代謝成各種化合物，這些化合物多數(shù)已知能誘導(dǎo)細胞生長及EGF 受體和MAPK 的活化。LPL 可被溶血磷脂酶D 代謝形成溶血磷脂酸。抑制PLA2 會改變AA 和LPA 的釋放，這可能會降低EGFR 和MAPK基礎(chǔ)激活，以及GPCR 途徑抑制劑降低癌細胞生長能力。研究［34］發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶6（Peroxiredoxin 6，PRDX6）能誘導(dǎo)HCC 細胞的S 期停滯并且抑制HCC 的癌變，而PRDX6 的iPLA 活性促進了TNF?α的癌細胞死亡。研究［35］表明，肝iPLA2β 在細胞氧化脂質(zhì)代謝和肝細胞死亡中的作用不同，肝臟iPLA2γ 可以減少有害氧化AA 代謝物產(chǎn)生，iPLA2γ的缺失減弱肝細胞中的細胞毒性。因此，iPLA2 激活參與HCC 肝癌細胞存活、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等過程。

3 展望

綜上所述，就目前來說，HCC 的治療對醫(yī)務(wù)人員來說仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。PLA2 與HCC 之間存在著緊密聯(lián)系，可考慮將PLA2 作為HCC 潛在的治療靶點。研究證實，激活PLA2 會加快HCC 進展，或許可以通過開發(fā)抑制PLA2 相關(guān)的藥物來阻斷HCC 的發(fā)展，提高HCC 患者的生存率。PLA2參與肝臟炎癥過程，可以考慮將PLA2 相關(guān)藥物應(yīng)用于肝臟疾病早期，從而減緩肝炎反應(yīng)強度，阻斷甚或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程，減少HCC 發(fā)病。激活PLA2 會引發(fā)AA 級聯(lián)反應(yīng)，或許通過抑制PLA2介導(dǎo)的AA 級聯(lián)反應(yīng)可作為治療HCC 藥物靶點。PLA2 在炎癥、肝臟疾病中扮演重要角色，可進一步闡明它們之間作用機制，將PLA2 應(yīng)用到其他肝臟疾病治療中。但想要將其應(yīng)用到臨床實踐中，仍有許多困難需要去跨越：（1）PLA2 與HCC 之間相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，兩者之間作用機制尚未完全清晰，深入探索他們之間具體分子機制，可為臨床奠定堅實理論基礎(chǔ)；（2）PLA2 研究主要集中在iPLA2，而對于cPLA2 的相關(guān)研究較少，需要加大對cPLA2 研究工作，以明確cPLA2 更多生理功能及其在HCC 形成與發(fā)展中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)；（3）目前的基礎(chǔ)研究工作大多停留在動物研究上，而人體研究數(shù)據(jù)相對較少，需要挖掘更多的人體研究數(shù)據(jù)，才能更接近臨床實際。