沉默信息調(diào)節(jié)因子1基因多態(tài)性與廣西人群顯微鏡下多血管炎的病例對(duì)照研究

馮菲 藍(lán)晶晶 薛超

1廣西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（南寧 530021）；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科（南寧 530007）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）相關(guān)性血管炎（AAV）是一種罕見的異質(zhì)性疾病，主要表現(xiàn)為中小血管的炎癥和壞死。AAV 通常包括以下臨床亞型：肉芽腫伴多血管炎（GPA）、顯微鏡下多血管炎（MPA）和嗜酸性肉芽腫伴多血管炎（EGPA）［1］。既往研究表明，地理和民族差異導(dǎo)致AAV 在不同地區(qū)的臨床表型存在差異。肉芽腫伴多血管炎（GPA）是北歐人群AAV 的主要類型，而顯微鏡下多血管炎（MPA）是亞洲人群AAV 的主要類型［2］。據(jù)報(bào)道，MPA 的發(fā)病率為0.5～24.0 例/百萬(wàn)人年，患病率為9.0～94.0 例/百萬(wàn)人年，發(fā)病年齡為55～75 歲［3］。

AAV 的發(fā)病機(jī)制未闡明，流行病學(xué)的顯著差異［4］提示了AAV 具有遺傳易感性背景。研究發(fā)現(xiàn)，AAV 與CTLA-4、FCGR2A、PTPN22、SERPINA1、TLR1 和TLR9 等遺傳變異之間存在顯著相關(guān)性，這些變異均來(lái)自非MHC 區(qū)域。不同臨床亞型其遺傳背景不同。例如，GPA 與HLA-DP1 有關(guān)，MPA與HLA-DQ 有關(guān)，EGPA 與HLA-DRB4 有關(guān)。上述成果不僅有助于解釋AAV 的病因，還可為診斷和靶向治療提供生物標(biāo)志物［5］。Sirtuins 家族，其獨(dú)一無(wú)二的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的去乙?；腹δ芤鹆巳藗兊膹V泛關(guān)注。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1），sirtuins 家族成員之一，承擔(dān)了p53、叉頭盒O（FoxO）等多種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同調(diào)節(jié)因子的去乙?；?。SIRT1 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌參與糖代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌功能、炎癥和腫瘤發(fā)生等生理過程［6］。此外，SIRT1 可影響多種自身免疫性疾病的發(fā)病，如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、炎性腸?。↖BD）、多發(fā)性硬化癥（MS）等，是自身免疫性疾病的潛在治療靶點(diǎn)［7］。然而，目前未見SIRT1 基因變異與MPA的關(guān)聯(lián)性研究。為此，本研究選擇rs1467568 和rs4746720 為候選SNP，探索SIRT1 突變是否影響廣西人群MPA 的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究的病例組源于2005-2020年在廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科、風(fēng)濕病科確診為MPA的患者，共208例。納入的MPA患者中，包括78 例男性（37.5%）和130 例女性（62.5%），平均年齡為（54.6±14.9）歲。其嚴(yán)格參照2012 年Chapel Hill 國(guó)際血管炎命名會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷［8］，排除了由感染、藥物治療、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和類風(fēng)濕性紫癜（HSP）等引起的繼發(fā)性血管炎。同時(shí)，選取了211 例與MPA組年齡、性別較為匹配的健康志愿者作為對(duì)照組。其中包含了83 例男性（39.3%）和128 例女性（60.7%），平均年齡為（51.2±12.6）歲。一切遵循世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)《赫爾辛基宣言》原則，已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2018 KY-0100）。所有受試者均簽署了書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集收集MPA 患者的一般資料、臨床資料與實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)。一般資料包括受試者的年齡、性別、血壓等。臨床資料的收集以MPA患者發(fā)病所伴隨的咳嗽、發(fā)熱、水腫等一系列臨床癥狀為主。實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)，即紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)以及其他檢測(cè)指標(biāo)。

1.2.2 基因組DNA 的提取采集所有受試者的外周靜脈血5 mL 置于EDTA 抗凝采血管，根據(jù)DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］操作說明提取外周血DNA。所納入的DNA 樣本：DNA純度（A260/A280）：1.8～2.0，DNA濃度> 50 μg/mL，將標(biāo)本放置-20 ℃冰箱以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 目的SNP 的選取利用Ensembl 瀏覽器（https：//ensemblgenomes.org）對(duì)中國(guó)南方漢族人群（CHS）和中國(guó)北京漢族人群（CHB）進(jìn)行基因座選擇。其篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）最小等位基因頻率（MAF）≥ 0.05；（2）遵循哈迪-溫伯格平衡（Hardy?Weinberg Equilibrium，HWE），P> 0.05；（3）已有文獻(xiàn)證明目標(biāo)位點(diǎn)與自身免疫性疾病相關(guān)。

1.2.4 基因分型通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)合高通量測(cè)序法［生工生物工程（上海）股份有限公司］對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。首先，需設(shè)計(jì)并合成引物池，然后通過兩步PCR 法擴(kuò)增SNP 位點(diǎn)序列制備一個(gè)Illumina 測(cè)序文庫(kù)。首輪擴(kuò)增體系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL；上游引物池（10 μmol/L）1 μL；下游引物池（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL （總體積25 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。待反應(yīng)體系配制好后，通過PCR 儀（BIO-RAD，T100TM）完成如下擴(kuò)增：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8 個(gè)循環(huán)；98 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。待反應(yīng)完成，溫度維持在4 ℃以保存產(chǎn)物；利用1%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物將被AMPure XP 磁珠純化回收。

第二輪的擴(kuò)增須以首輪產(chǎn)物為模板，目的是獲得測(cè)序帶分子標(biāo)簽的文庫(kù)。反應(yīng)體系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL，通用P7 引物（含分子標(biāo)簽，10 μmol/L）1 μL；通用P5引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL （總體積30 μL）。體系準(zhǔn)備就緒后，進(jìn)行如下擴(kuò)增：98 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共5 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物仍在4 ℃中進(jìn)行保存。PCR 產(chǎn)物仍以AMPure XP 磁珠純化回收方式進(jìn)行回收。待所有擴(kuò)增產(chǎn)物混合后，將通過HiSeq XTen 測(cè)序儀（Illumina，San Diego，CA）展開測(cè)序。引物序列依次為：F1：5′-CCAATGAAGTTCTTTCTACAGCACA-3′，R1：5′-ATGCAGTATGAAAAAGTTCGAGAGC-3′，F(xiàn)2：5′AAAAGTAAAGA?CAACCGAGTGCTCT-3′，R2：5′-AGTTTTCAAAAAGCCATCGGAATGT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)于正態(tài)分布/近似正態(tài)分布的定量資料，采用（±s）描述其平均水平；而偏態(tài)分布的計(jì)量資料則用M（P25，P75）表示。利用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率檢驗(yàn)來(lái)估計(jì)兩組間的基因型和等位基因頻率分布。通過SHEsis 生信軟件進(jìn)行連鎖不平衡（LD）和單體型分析。應(yīng)用SNPstats 生信網(wǎng)站進(jìn)行年齡分層分析，計(jì)算和評(píng)估五種遺傳模型下的基因型與MPA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（ORS）和95%置信區(qū)間（CIS）。采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型、等位基因頻率的比較MPA組與對(duì)照組均符合Hardy?Weinberg 平衡（MPA 組：χ2=0.569，P=0.451；對(duì)照組：χ2=0.641，P=0.423），即證明所納入的研究對(duì)象具人群代表性。Rs1467568、rs4746720 的基因型、等位基因頻率在兩組中的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見表1。

表1 SIRT1 rs1467568、rs4746720 基因型和等位基因在MPA 組和對(duì)照組中的分布Tab.1 Distribution of SIRT1 rs1467568 and rs4746720 genotype and allele in MPA group and control group 例（%）

2.2 按年齡分層后的遺傳模型分析Rs1467568的顯性模型（OR=0.50，95%CI：0.27～0.92，P=0.026）、超顯性模型（OR=0.49，95%CI：0.26～0.92，P=0.026）和加性模型（OR=0.57，95%CI：0.33～0.99，P=0.045）均能降低老年組（≥ 54 歲）MPA 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而rs4746720 的各遺傳模型均顯示兩個(gè)不同年齡組的個(gè)體與MPA 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)缺乏相關(guān)性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見表2。

表2 SIRT1 基因多態(tài)性在不同年齡段人群中的分布以及與MPA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.2 Distribution of SIRT1 gene polymorphisms in different age groups and its association with the risk of MPA

2.3 基因型與臨床癥狀的相關(guān)性分析Rs1467568、rs4746720 各基因型與發(fā)熱、咳嗽、水腫、咯血、血尿以及蛋白尿癥狀的發(fā)生差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見表3。

表3 rs1467568、rs4746720 各基因型的臨床癥狀比較（MPA 組）Tab.3 Comparison of clinical symptoms of rs1467568 and rs4746720 genotypes （MPA group） 例（%）

2.4 基因型與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的分析在MPA 患者中，與AA、AG（rs1467568）基因型相比，GG 基因型的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）；而CC（rs4746720）基因型的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平較TT、TC 基因型低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036）。除此之外，兩位點(diǎn)的基因型與其他各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見表4。

表4 rs1467568、rs4746720 各基因型與實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析（MPA 組）Tab.4 Analysis of the relationship between rs1467568，rs4746720 genotypes and laboratory biochemical indexes（MPA group）M（P25，P75）

2.5 連鎖不平衡與單體型分析研究證明，SIRT1 rs1467568 和rs4746720 處于完全連鎖不平衡狀態(tài)（D1=1.000，r2=0.141）；兩位點(diǎn)所構(gòu)建的單體型與MPA 的遺傳易感性并不相關(guān)（P> 0.05），見表5。

表5 單體型與MPA 遺傳易感性的關(guān)系Tab.5 Relationship between haplotypes and genetic susceptibility to MPA 例（%）

3 討論

ANCA 相關(guān)性AAV 是一種死亡率高且易復(fù)發(fā)的自身免疫性疾病。免疫抑制劑的問世使AAV在治療方面實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，該血管炎可從產(chǎn)生癥狀后1～2 年內(nèi)死亡率極高的異質(zhì)性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)樾杞K生治療的慢性疾病。但非特異性治療帶來(lái)的不良免疫和代謝反應(yīng)，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量乃至威脅生命健康。故該病的治療領(lǐng)域中挑戰(zhàn)一直存在［3］。

該血管炎的發(fā)病機(jī)制可受遺傳因素、環(huán)境因素等影響，其發(fā)病過程因復(fù)雜而備受爭(zhēng)議。既往研究［9］證實(shí)了ANCAs 過度激活中性粒細(xì)胞可誘導(dǎo)其形成中性粒細(xì)胞外陷阱（NETs），且NETs 可通過ANCA的介導(dǎo)導(dǎo)致血管損傷并參與ANCAs的產(chǎn)生。故認(rèn)為NETs 與ANCA 調(diào)控所形成的惡性循環(huán)有助于AAV 的發(fā)病。體外實(shí)驗(yàn)［10］表明ANCA 可誘導(dǎo)自噬，而自噬對(duì)ANCA 所誘導(dǎo)的NETs 的形成發(fā)揮促進(jìn)作用。ZHU 等［11］通過功能獲得和功能喪失實(shí)驗(yàn)證明了SIRT1 介導(dǎo)的FoxO1 易位和去乙?；贖2S 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中扮演重要角色；且H2S 對(duì)血管的保護(hù)作用由SIRT1-FoxO1 信號(hào)通路介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬完成?；谝陨涎芯勘尘?，猜測(cè)SIRT1 可能參與ANCA 相關(guān)性血管炎的發(fā)病，SIRT1 啟動(dòng)自噬，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞外部網(wǎng)（NETs）的紊亂，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管。

SIRT1 蛋白是一種NAD+依賴的去乙?；?，高度保守［12］，是sirtuin 家族中研究最深入的一員。SIRT1 對(duì)免疫反應(yīng)的有效調(diào)節(jié)［13］源于該基因?qū)Χ喾N蛋白的乙?；揎?，其中包括了組蛋白、代謝酶等［14-15］。SIRT1 的表達(dá)與多種血管炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)已被報(bào)道。XIE 等［16］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在活動(dòng)性眼部白塞病患者中，SIRT1 表達(dá)降低；而后續(xù)實(shí)驗(yàn)直接證實(shí)了活動(dòng)性眼部白塞病的發(fā)生得益于SIRT1 表達(dá)的降低影響了Th17 和Th22 細(xì)胞的反應(yīng)。意大利的一項(xiàng)橫斷面研究［17］顯示，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎（GCA）患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）中SIRT1 的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，不由得猜測(cè)GCA 患者SIRT1 表達(dá)的降低可能受并行的氧化應(yīng)激影響，其過程可能涉及該血管炎的發(fā)病機(jī)制，需更深入研究證明此觀點(diǎn)。SHIMOJIMA 等［18］試圖探究ANCA 相關(guān)性管炎（AAV）中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）穩(wěn)定性與活性氧的關(guān)系時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，相比于健康對(duì)照組，AAV 患者Treg 中SIRT1 表達(dá)降低；經(jīng)白藜蘆醇治療后的AAV 患者Treg 表現(xiàn)為SIRT1表達(dá)升高。近年來(lái)，SIRT1 的遺傳變異已被廣泛討論。HOU 等［19］研究顯示，rs1467568 AG 基因型可能是1 型心腎綜合征（CRS1）發(fā)病的保護(hù)因素（P=0.019）。在529例中國(guó)漢族類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和700 例健康對(duì)照中［20］，學(xué)者發(fā)現(xiàn)rs1467568 可影響中國(guó)漢族人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性（P=0.011）。有趣的是，在糖尿病腎?。?1］中，rs4746720 的TC 基因型攜帶者發(fā)生該疾病的風(fēng)險(xiǎn)低于TT、CC 基因型攜帶者（P< 0.01），但T 等位基因又是糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因（P=0.01）。還有研究［22］表明SIRT1 已成為治療2 型糖尿病的一個(gè)很有前景的治療靶點(diǎn)。更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SIRT1 rs12778366 位點(diǎn)可能/間接影響2 型糖尿病的遺傳易感性；還可能影響SIRT1 mRNA 的表達(dá)并進(jìn)一步影響利拉魯肽和二甲雙胍對(duì)既往血糖控制不佳 2 型糖尿病患者臨床療效［23］。本研究結(jié)果表明，在年齡≥ 54 歲亞組中，rs1467568 的顯性模型AA+AG 基因型、超顯性模型AG 基因型以及加性模型可能與MPA易感性降低相關(guān)，可視為疾病發(fā)生的保護(hù)因素，這與其他研究結(jié)果類似。Rs1467568位于內(nèi)含子區(qū)域，其位點(diǎn)可能通過中斷翻譯和剪接的過程影響SIRT1 基因的轉(zhuǎn)錄，改變氨基酸序列。SIRT1 可因其去乙?；富钚灾苯訁⑴c自噬過程的調(diào)節(jié)，還可通過間接改變上游調(diào)控因子實(shí)現(xiàn)自噬活性的調(diào)節(jié)［24］。故猜想，SIRT1 的遺傳變異（rs1467568）導(dǎo)致SIRT1自身的表達(dá)異常，進(jìn)而啟動(dòng)自噬，影響MPA 易感性。

本次實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示，患者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（rs1467568）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（rs4746720）水平在不同基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早有研究證明SIRT1 在維持代謝過程（包括糖異生和脂質(zhì)合成）的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用，從而影響肝臟再生過程［25-26］。筆者大膽推測(cè)，SIRT1 基因的遺傳變異影響了自身去乙酰化過程，從而影響了肝臟的代謝，造成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在不同基因型之間存在差異。

本研究在探討SIRT1 基因多態(tài)性與MPA 易感性相關(guān)性過程中，存在多處空白：樣本量小，部分臨床資料缺失，影響統(tǒng)計(jì)分析；研究人群僅來(lái)自一個(gè)地區(qū)，存在選擇偏倚等。因此，將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，完善臨床資料，深入研究SIRT1 遺傳變異與MPA 發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，SIRT1 rs4746720與廣西人群的MPA風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。盡管其他結(jié)果顯示SIRT1 rs1467568 與MPA 無(wú)相關(guān)性，但年齡分層分析顯示，rs1467568（年齡≥ 54 歲）的顯性模型、超顯性模型以及加性模型降低了MPA 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另外，SIRT1多態(tài)性rs1467568 可能與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平相關(guān)、rs4746720 與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平相關(guān)。