布洛芬對(duì)缺血性腦中風(fēng)大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路的影響

何俊榮 劉仔 陳錫培

廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院（廣東東莞 523000）

中風(fēng)是全球死亡率和殘疾的重要引發(fā)因素，每年有1 030 萬(wàn)人群出現(xiàn)中風(fēng)病例，具有“四高一多”特點(diǎn)［1-2］，目前溶栓治療是缺血性腦卒中（isch?emic stroke，IS）最有效的治療方法，但僅少數(shù)患者可在腦卒中發(fā)病后4～6 h 內(nèi)接受有效的溶栓治療。因此探索IS 的發(fā)病機(jī)制對(duì)于制定有效的治療策略至關(guān)重要［3］。布洛芬是一種非甾體抗炎藥，目前已被證明可改善認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)炎癥［4］，但其對(duì)治療IS 鮮有報(bào)道。鐵死亡是一種依賴鐵的細(xì)胞死亡形式，與多種病理狀況有關(guān)，包括創(chuàng)傷性腦損傷、神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)［35］。核因子E2 相關(guān)因子2（nucler factor erythroid related factor 2，Nrf2）是控制細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2 作為轉(zhuǎn)錄因子可增加非糖基化的xCT（SLC7A11）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的表達(dá)，激活Nrf2 信號(hào)還可以通過對(duì)抗鐵死亡保護(hù)細(xì)胞［6］。研究［7］顯示，布洛芬可通過調(diào)節(jié)Nrf2 信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的鐵死亡，是一種潛在的膠質(zhì)瘤治療藥物，提示布洛芬與Nrf2 介導(dǎo)的鐵死亡具有一定的聯(lián)系，但布洛芬能否通過Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路對(duì)IS 發(fā)揮保護(hù)作用目前并無(wú)報(bào)道。因此本研究通過大腦中動(dòng)脈梗死模型復(fù)制IS 大鼠，旨在探討布洛芬對(duì)IS 大鼠神經(jīng)保護(hù)的影響及相關(guān)作用機(jī)制，為IS 治療提供潛在治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質(zhì)量220～260 g，6～7 周齡）購(gòu)自完美（廣東）日用品有限公司，許可證號(hào)：SYXK（粵）2022-0288。所有大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠（每個(gè)籠子少于5 只動(dòng)物）中，溫度設(shè)定（22±1）°C，光照/黑暗周期為12 h，濕度為60%～70%。大鼠隨意獲取食物和水，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑上海吉至生化科技有限公司提供布洛芬（純度99.0%，CAS：15687-27-1，1 g）；美國(guó)Med-ChemExpress 公司提供Nrf2 抑制劑-ML385（純度99.55%，編號(hào)：S8790，25 mg）；天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供2，3，5-三苯四唑氯化物（TTC）；北京索萊寶科技有限公司提供蘇木精-伊紅染色液（HE）、RIPA 高效蛋白裂解液；浙江奧的特生物技術(shù)有限公司鐵離子試劑盒；Abcam公司提供Nrf2、SLC7A1、GPX4 一抗。

1.2 方法

1.2.1 IS 大鼠模型的制備及干預(yù)將適應(yīng)性喂養(yǎng)1周的大鼠分為造模組（48只）及假手術(shù)組（12只），造模組大鼠參考文獻(xiàn)［8］制備IS 大鼠模型。首先將大鼠麻醉，將右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）和頸外動(dòng)脈小心暴露并從周圍組織分離，將一根直徑為0.26 mm的尼龍絲經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插入（約20 mm）到右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈血流。缺血60 min 后，小心拉出尼龍絲開始再灌注24 h，假手術(shù)操作同上，但僅分離動(dòng)脈，不進(jìn)行缺血再灌注操作。IS 大鼠模型的選取標(biāo)準(zhǔn)為［9］：（1）大鼠蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)旋轉(zhuǎn)；（2）參考Zea-Longa 評(píng)分對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分［10］，評(píng)分為1-3 分的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。造模過程中48 只大鼠均無(wú)死亡且符合IS 造模標(biāo)準(zhǔn)。

造模組大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組IS 組、治療組、抑制劑組、治療+抑制劑組。其中假手術(shù)組及IS 組給予生理鹽水干預(yù)；治療組以腹腔注射30 mg/kg布洛芬（1 mL/kg 的布洛芬藥液為30 mg/kg）干預(yù)；抑制劑組以腹腔注30 mg/kg ML385 干預(yù)（1 mL/kg的ML385 為30 mg/kg）；治療+抑制劑組同時(shí)給予腹腔注射30 mg/kg 布洛芬、30 m/kg ML385 干預(yù)；每天干預(yù)1 次，連續(xù)干預(yù)1 周。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分給藥結(jié)束后，參考Zea-Longa評(píng)分對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分越高，表明大鼠神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

1.2.3 TTC 檢測(cè)大鼠腦梗死率各組隨機(jī)選取3 只大鼠，麻醉大鼠并快速斷頭取腦，在-20 ℃下快速冷凍30 min，將大腦從額極到枕極切成2 mm厚的冠狀切片，然后加入2% TTC 溶液在37 ℃下避光染色20 min，然后在4%多聚甲醛中固定2 h以上，正常組織為紅色，而梗塞組織呈白色。通過Image J 軟件分析梗塞區(qū)域，計(jì)算梗死率［（缺血對(duì)側(cè)半球體積-缺血側(cè)非梗死體積）/缺血對(duì)側(cè)半球體積×100%］。

1.2.4 腦水腫含量測(cè)定各組隨機(jī)選取3 只大鼠，取出大腦，制備5 mm 厚冠狀腦切片，電子天平稱取重量，記為腦濕重，然后在真空烘箱中100 ℃下干燥48 h 并重新稱重，記為腦干重，計(jì)算腦水腫含量［（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%］。

1.2.5 樣本采集各組剩余6 只大鼠經(jīng)麻醉后，開顱取腦，快速取出缺血半暗帶區(qū)域腦組織，一式2 份，一份經(jīng)4%多聚甲醛固定，用于HE 染色；另一份保存在-80 ℃冰箱中用于試劑盒檢驗(yàn)及qRTPCR、Western blot 檢測(cè)。

1.2.6 HE檢測(cè)大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化取出1.2.5 中經(jīng)4%多聚甲醛固定的腦組織，經(jīng)脫水，石蠟包埋后，制備厚度為4 μm 切片，經(jīng)HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡觀察腦組織中神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織中鐵離子含量變化取出1.2.5 中部分腦組織0.25 g 制作組織勻漿，離心取上清，按照鐵離子試劑盒說明書操作，進(jìn)行檢測(cè)腦組織中鐵離子含量。

1.2.8 qRT?PCR 檢測(cè)腦組織中SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)水平使用TRIzol 試劑從組織提取RNA，將RNA 以逆轉(zhuǎn)錄盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以Applied Biosystems 7900 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR，引物序列為GPX4，上游引物5′-AAGGACCTGCCCCACTATTTC-3′，下游引物5′-ACGCTGGATTTTCGGGGTCT-3′；SLC7A1，上游引物5′-GGTACTGCAATCACAATGCCAGA-3′，下游引物5′-GCACATGCATCAAGAGTTTCCATAA-3′；βactin，上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，2-ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)。

1.2.9 Western blot 檢測(cè)腦組織中Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)使用RIPA 裂解緩沖液從剩余腦組織中提取蛋白質(zhì)，分離并轉(zhuǎn)膜上，封閉之后將膜與Nrf2、SLC7A1、GPX4 一抗在4 ℃下孵育過夜。第2 天，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 檢測(cè)試劑顯色條帶，Image J 軟件用于分析蛋白條帶，其中β-actin 作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P< 0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；單因素方差分析用于多組間比較，以SNK?q檢驗(yàn)進(jìn)一步兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 布洛芬對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死率、腦水腫及鐵離子含量的影響神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死率、腦水腫、鐵離子含量比較：IS 組較假手術(shù)組、抑制劑組較IS 組、治療+抑制劑組較治療組增加，但治療組較IS 組、治療+抑制劑組較抑制劑組降低（P< 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死率、腦水腫、鐵離子含量的比較Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction rate，brain edema and iron ion content of rats in each group ±s

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死率、腦水腫、鐵離子含量的比較Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction rate，brain edema and iron ion content of rats in each group ±s

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與IS組比較，bP<0.05；與治療組比較，cP<0.05；與抑制劑組比較，dP<0.05

組別假手術(shù)組IS組治療組抑制劑組治療+抑制劑組鐵離子含量95.12±9.51 171.29±17.13a 99.38±9.94b 216.45±21.65b 189.72±18.98cd神經(jīng)功能評(píng)分（分）0.00±0.00 2.11±0.22a 0.84±0.10b 3.16±0.32b 1.52±0.16cd腦梗死率（%）0.00±0.00 20.51±2.06a 11.29±1.13b 32.19±3.22b 19.43±1.95cd腦水腫含量（%）62.34±2.14 71.15±2.32a 63.15±2.12b 81.42±3.15b 72.11±2.25cd

2.2 布洛芬對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響假手術(shù)組大鼠腦組織中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰、排列緊密；IS 組細(xì)胞形態(tài)模糊不清，排列無(wú)規(guī)則，神經(jīng)元數(shù)目減少；治療組神經(jīng)元變性有所改善；抑制劑組神經(jīng)元數(shù)目驟減，細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，細(xì)胞核嚴(yán)重固縮；治療+抑制劑組神經(jīng)元數(shù)目及細(xì)胞排列稍有所改善。見圖1。

2.3 布洛芬對(duì)大鼠腦組織SLC7A11、GPX4 mRNA表達(dá)水平SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)：IS 組較假手術(shù)組、抑制劑組較IS 組、治療+抑制劑組較治療組均降低，但治療組較IS 組、治療+抑制劑組較抑制劑組均增加（P< 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織中SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of the expression of SLC7A11 and GPX4mRNA in brain tissue of rats in each group xˉ±s

2.4 布洛芬對(duì)大鼠腦組織Nrf2/SLC7A11/GPX4通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Nrf2、SLC7A11、GPX4表達(dá)比較：IS 組較假手術(shù)組、抑制劑組較IS 組、治療+抑制劑組較治療組降低，但治療組較IS 組、治療+抑制劑組較抑制劑組增加（P< 0.05）。見圖2、表3。

圖2 大鼠腦組織中各蛋白表達(dá)（Western blot 圖）各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達(dá)的比較Fig.2 Expression of proteins in rat brain （Western blot）Comparison of expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in brain tissue of rats in each group ±s

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in brain tissue of rats in each group ±s

注：與假手術(shù)組比較，aP < 0.05；與IS組比較，bP < 0.05；與治療組比較，cP < 0.05；與抑制劑組比較，dP < 0.05

GPX4/β-actin 0.76±0.08 0.43±0.05a 0.72±0.08b 0.19±0.02b 0.49±0.05cd組別假手術(shù)組IS組治療組抑制劑組治療+抑制劑組Nrf2/β-actin 0.94±0.10 0.43±0.05a 0.86±0.09b 0.18±0.02b 0.52±0.06cd SLC7A11/β-actin 1.16±0.12 0.64±0.07a 1.02±0.11b 0.35±0.04b 0.67±0.07cd

3 討論

缺血性中風(fēng)可占中風(fēng)病例的約80%，局灶性缺血性中風(fēng)是由大腦中動(dòng)脈閉塞引起的，導(dǎo)致血液供應(yīng)不足使神經(jīng)細(xì)胞中葡萄糖和氧氣短缺，致使神經(jīng)功能受損，給患者和社會(huì)都帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［11］。由于靜脈溶栓治療中風(fēng)的窗口期較短，許多患者沒有得到及時(shí)治療，因此有必要開發(fā)新的治療策略［12］。

布洛芬是一種非甾體抗炎藥，具有解熱、抗炎和鎮(zhèn)痛作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)IS 組大鼠神經(jīng)元數(shù)目減少，細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則，神經(jīng)功能評(píng)分增加，TTC染色顯示腦梗死率增加，而經(jīng)布洛芬干預(yù)后，腦梗死率降低，提示布洛芬對(duì)IS 大鼠神經(jīng)功能障礙具有改善作用，與先前結(jié)果一致［14］。本研究還發(fā)現(xiàn)IS 組大鼠腦水腫含量增加，與前人研究結(jié)果一致［15］，在此基礎(chǔ)上布洛芬干預(yù)，腦水腫含量降低，可進(jìn)一步表明布洛芬可保護(hù)IS 大鼠神經(jīng)功能。此外，布洛芬對(duì)短暫前腦缺血的大鼠可減少炎性因子的分泌，具有神經(jīng)保護(hù)作用［16］。布洛芬還可減少神經(jīng)元損傷，降低宮內(nèi)生長(zhǎng)受限新生兒大腦的炎癥反應(yīng)，可作為保護(hù)新生兒大腦的潛在治療策略［17］。本研究推測(cè)布洛芬可能通過抗炎作用降低神經(jīng)功能評(píng)分，抑制腦梗死率、腦水腫含量，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)IS 大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證還在進(jìn)行中。

GPX4 是一種抗氧化防御酶，是多種細(xì)胞類型中鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過誘導(dǎo)鐵死亡并引發(fā)前腦神經(jīng)元的神經(jīng)變性［18］。Nrf2 是一種重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)SLC7A11 和GPX4 的表達(dá)，如山奈酚通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路保護(hù)氧-葡萄糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷及鐵死亡［19］。本研究發(fā)現(xiàn)IS 組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達(dá)降低，提示IS 大鼠神經(jīng)受損可能與Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路被抑制有關(guān)。除此之外，葡萄籽原花青素通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路，減輕高糖高脂誘導(dǎo)的鐵死亡，提高細(xì)胞生存率［20］。鹿紅方可減輕心肌缺血再灌注損傷，可能是通過上調(diào)SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)［21］。而本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)布洛芬干預(yù)后，Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達(dá)顯著增加，大鼠神經(jīng)受損得到改善，猜測(cè)布洛芬可能是通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路改善IS 大鼠神經(jīng)受損。為驗(yàn)證該猜測(cè)，實(shí)驗(yàn)在布洛芬干預(yù)的基礎(chǔ)上以Nrf2 抑制劑-ML385 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ML385 逆轉(zhuǎn)了布洛芬對(duì)IS 大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用，進(jìn)一步表明布洛芬可以保護(hù)IS 大鼠神經(jīng)功能受損，可能與激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路介導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。

綜上所述，布洛芬通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)IS 大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用，為IS 治療提供理論依據(jù)。但藥物發(fā)揮作用機(jī)制較為復(fù)雜，文章僅從抑制劑方面進(jìn)行驗(yàn)證，存在一定的不足，后續(xù)使用激活劑及炎癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均將進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。