NNK對(duì)NCTC 1469細(xì)胞毒性作用的研究

韓亞偉 王西華 陳利平 時(shí)桂芹 孫麗萍 周文珊

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州　450001）

NNK對(duì)NCTC 1469細(xì)胞毒性作用的研究

韓亞偉 王西華 陳利平 時(shí)桂芹 孫麗萍 周文珊

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州450001）

研究4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）對(duì)小鼠肝細(xì)胞NCTC 1469細(xì)胞的毒性作用。利用MTT比色法檢測(cè)5個(gè)不同NNK濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）對(duì)細(xì)胞的毒性作用；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡基因Bcl-2和Bax的表達(dá)。MTT顯示，NNK能降低NCTC 1469細(xì)胞存活率，并呈劑量和時(shí)間依賴性。鏡檢結(jié)果可見(jiàn)細(xì)胞皺縮，密度降低；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的NNK作用24 h后凋亡率分別為（16.79±2.01）%、（26.87±1.67）%、（41.78±3.19）%、（50.89±3.94）%和（65.86±4.54）%，顯著高于對(duì)照組（7.46±1.58）%；熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著NNK濃度的增加，Bcl-2 mRNA的表達(dá)減少，Bax mRNA的表達(dá)逐漸上升。NNK能夠降低NCTC 1469細(xì)胞存活率并誘導(dǎo)其凋亡，作用呈劑量和時(shí)間依賴性。

NNK；NCTC 1469細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞儀

卷煙煙氣的化學(xué)成分多達(dá)3 800多種［1］，其中大多數(shù)成分是無(wú)害的，只有少數(shù)有害［2］。弄清楚這些有害成分的致病作用機(jī)制及其抑制途徑，對(duì)于保護(hù)卷煙消費(fèi)者的健康具有重要意義。煙草特有亞硝胺（TSNAs）是由煙草內(nèi)源性生物堿通過(guò)亞硝胺化作用而產(chǎn)生的，是只存在于煙草、煙草制品和煙草煙氣中的亞硝胺類(lèi)化合物。到目前為止，尚未在其他食品中發(fā)現(xiàn)［3］。有關(guān)TSNAs的研究報(bào)道很多，不僅是因?yàn)樗鼈兪菬煵葜破返闹饕泻Τ煞种?，它還對(duì)機(jī)體健康造成極大危害，有證據(jù)表明，TSNAs與肺部、口腔、食道、胰臟、肝臟等部位發(fā)生的病變有關(guān)［4］。而4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）是TSNAs中含量高、致癌能力強(qiáng)的一種烷化劑類(lèi)致癌物［5］，是卷煙主流煙氣的代表性有害成分之一［6，7］，國(guó)際癌癥組織將其列為一級(jí)致癌物［8］。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，NNK可誘發(fā)多種動(dòng)物的多種腫瘤發(fā)生。我們研究組所構(gòu)建的小鼠毒理模型顯示，吸煙和灌胃的動(dòng)物模型中，對(duì)小鼠的肺部細(xì)胞和肝部細(xì)胞損傷最大［9，10］。鑒于報(bào)道的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及我們前期研究的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)小鼠正常肝細(xì)胞（NCTC 1469細(xì)胞）為研究對(duì)象，采用四氮唑鹽比色分析法（MTT法）和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，觀察不同劑量NNK對(duì)NCTC 1469的細(xì)胞毒性及凋亡情況，為進(jìn)一步研究NNK誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肝細(xì)胞NCTC 1469購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；NNK購(gòu)自Toronto Research Chemicals Inc；DMEM培養(yǎng)液、噻唑藍(lán)、胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物大連有限公司；CO2培養(yǎng)箱HF160W（Heal Force）；倒置相差顯微鏡（Observer A1，Zeiss）；流式細(xì)胞儀（Becton-Dickinson，F(xiàn)ACS Calibur）；酶標(biāo)儀（GENEios Plus，TECAN）；熒光定量PCR（Stepone Plus，ABI）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)研究。

1.2.2 NNK對(duì)細(xì)胞毒性作用的檢測(cè) 采用MTT比色法，用DMEM（含10%新生小牛血清）培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，置37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h后棄原培養(yǎng)液，再分別加入含NNK濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的新鮮DMEM培養(yǎng)液200 μL，陰性對(duì)照組加入不含NNK的等量完全培養(yǎng)基。同時(shí)設(shè)空白組對(duì)照調(diào)零，空白對(duì)照組除不加細(xì)胞外其余條件與陰性對(duì)照組相同，每組均設(shè)5個(gè)平行孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24和36 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液 20 μL，孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL/孔振蕩10 min后，檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下吸光度值（A）。按公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值）（/對(duì)照孔A值- 空白孔A值）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 NNK脅迫NCTC 1469細(xì)胞的形態(tài)觀察 將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中分別加入NNK 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，對(duì)照組不加NNK，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到六孔板中，次日，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含NNK濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的新鮮DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105mL，常規(guī)加入Annexin V-FITC及PI染色，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 凋亡基因Bcl-2和Bax的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組未加藥物，實(shí)驗(yàn)組加入NNK使其終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組NCTC 1469細(xì)胞分別用Trizol試劑提取RNA，依照提取試劑盒操作得到白色沉淀，加入0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）40 μL，使RNA完全溶解。紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA的A260和A280比值和含量，用DEPC水將各組總RNA調(diào)整至同一濃度，分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，基因引物序列詳見(jiàn)表1。根據(jù)Ct值計(jì)算出內(nèi)參基因和處理組基因的△Ct，再用對(duì)照組△Ct-處理組△Ct得到△△Ct，最終根據(jù)2-△△Ct得出處理組樣本基因相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量指標(biāo)用±s表示，組間比較用單因素方差分析（ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 NCTC 1469細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

倒置相差顯微鏡如圖1觀察可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞排列均勻，大小基本一致，輪廓清晰，懸浮細(xì)胞少。隨NNK濃度上升，細(xì)胞生長(zhǎng)密度逐漸下降，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮等形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞數(shù)量及生長(zhǎng)密度逐漸減少、細(xì)胞顆粒增多。經(jīng)0.1 mg/mL NNK作用24 h后的細(xì)胞，正常細(xì)胞減少，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞碎片。并且隨著NNK濃度逐漸增加，上述變化更加明顯。

圖1 不同濃度NNK作用24 h后NCTC 1469細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變（200x）

2.2 NNK對(duì)NCTC 1469細(xì)胞毒性作用

細(xì)胞存活率是細(xì)胞毒理作用的檢測(cè)指標(biāo)之一，MTT結(jié)果（表2）顯示，在不同濃度NNK的作用下，各藥物濃度組細(xì)胞存活率與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。線性回歸分析，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（12 h∶b= -0.085，P＜0.05；24 h∶b=-0.117，P＜0.05；36 h∶b=-0.138，P＜0.05）。且隨著時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，與同濃度組比較均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可見(jiàn)，NNK能降低NCTC 1469細(xì)胞存活率，并呈濃度和時(shí)間依賴性。

表2 不同濃度NNK在不同時(shí)間作用下對(duì)NCTC 1469細(xì)胞存活率的影響（%）

2.3 NCTC 1469細(xì)胞的凋亡情況

流式細(xì)胞儀Annexn V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡如圖2所示，由于晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（右上象限）多為早期凋亡細(xì)胞（右下象限）繼發(fā)而來(lái)，故將兩者之和記為總體凋亡率。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅約（7.46±1.58）%，NNK作用24 h后NCTC 1469細(xì)胞的凋亡率分別為（16.79±2.01）%、（26.87±1.67）%、（41.78±3.19）%、（50.89±3.94）%和（65.86±4.54）%。與對(duì)照組比較，不同濃度組間凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 NNK對(duì)NCTC 1469細(xì)胞Bcl-2和Bax基因表達(dá)的影響

如圖3所示，隨著NNK作用濃度的增加，NCTC 1469細(xì)胞的Bcl-2基因mRNA表達(dá)明顯減少，而B(niǎo)ax基因的mRNA表達(dá)上升，Bcl-2/Bax比值趨小。

3 討論

吸煙能引起并發(fā)癥已是不爭(zhēng)的事實(shí)［11］。香煙中主要的致癌物有兩大類(lèi)：一是多環(huán)芳烴類(lèi)，如苯并芘；二是亞硝胺，一支香煙燃燒產(chǎn)生的煙氣中有0.1-0.5 μg NNK［12］，NNK可引起DNA鏈斷裂、堿基突變、DNA加合物形成等，從而導(dǎo)致細(xì)胞病變［13-15］。小鼠毒理模型顯示煙氣能夠?qū)е赂尾繐p傷，可能與煙草特有亞硝胺有關(guān)。

圖2 NNK體外作用對(duì)NCTC 1469細(xì)胞凋亡率的影響

本研究之所以選用肝部細(xì)胞作為研究對(duì)象，主要基于前期的研究基礎(chǔ)，為進(jìn)一步揭示NNK損傷肝部細(xì)胞的機(jī)理而展開(kāi)的。在我們的前期研究中，無(wú)論吸煙還是灌胃的毒理模型中均顯示，肺部和肝部是損傷最大的組織。本研究通過(guò)NNK對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞NCTC 1469的脅迫作用，并為后期進(jìn)一步作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。MTT結(jié)果表明，NNK在體外能顯著降低NCTC 1469細(xì)胞的存活率，隨著NNK濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，提示NNK濃度和時(shí)間依賴性地影響細(xì)胞存活率。

細(xì)胞凋亡是由基因控制細(xì)胞主動(dòng)性自殺過(guò)程，其細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)機(jī)制的失控與癌變過(guò)程密切相關(guān)，且可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。經(jīng)NNK作用后的NCTC 1469細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)密度逐漸下降，體積縮小。作用24 h后，有大量不規(guī)則細(xì)胞脫落，細(xì)胞碎片較多。上述細(xì)胞形態(tài)變化說(shuō)明，NNK對(duì)NCTC 1469的脅迫能通過(guò)細(xì)胞凋亡程序來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞抑制作用。該研究采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)NNK體外作用對(duì)NCTC 1469細(xì)胞凋亡的影響。隨著NNK濃度的增加凋亡率逐漸上升，說(shuō)明NNK通過(guò)誘導(dǎo)NCTC 1469細(xì)胞程序性凋亡來(lái)抑制生長(zhǎng)。抑制機(jī)制可能有直接損傷細(xì)胞膜、影響線粒體的通透性［16］、阻滯細(xì)胞周期、降低MMP等。

圖3 不同濃度NNK處理NCTC 1469細(xì)胞24 h后Bcl-2和Bax m RNA的表達(dá)

細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，其原因和途徑是復(fù)雜多樣的，許多基因共同參與這一過(guò)程，包括抗凋亡基因和促凋亡基因。其中Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［17］。Bcl-2家族按其功能可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是促凋亡基因，代表基因是Bax基因，主要分布于線粒體的外膜上。Bax過(guò)度表達(dá)可以誘導(dǎo)某些細(xì)胞自發(fā)凋亡，且可以 參與并促進(jìn)其他因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另一類(lèi)是抗細(xì)胞凋亡基因，代表基因是Bcl-2，與腫瘤的發(fā)生和耐藥性密切相關(guān)。若Bcl-2和Bax表達(dá)量平衡則細(xì)胞正常生存，Bcl-2表達(dá)水平上升時(shí)可以和Bax結(jié)合形成異源二聚體抑制細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)水平上升可形成同源二聚體拮抗Bcl-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度NNK作用NCTC 1469細(xì)胞后檢測(cè)Bcl-2和Bax基因的表達(dá)水平，隨著藥物濃度的上升，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)量下降，而B(niǎo)ax基因的mRNA表達(dá)上升，Bcl-2/Bax比例下降，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性的關(guān)系，由此說(shuō)明，NNK誘導(dǎo)NCTC 1469細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2 mRNA和上調(diào)Bax mRNA表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞毒理模型初步建立階段，我們選擇經(jīng)典的Bcl-2和Bax基因作為研究對(duì)象，雖然mRNA定量PCR結(jié)果能反映出NNK能誘導(dǎo)Bcl-2和Bax發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)變化，但兩基因翻譯成功能蛋白還需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后的修飾和蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控；如果僅通過(guò)Western blot來(lái)驗(yàn)證Bcl-2和Bax表達(dá)蛋白的量的變化，既脫離不了常規(guī)的研究方法，又不能對(duì)兩基因的調(diào)控機(jī)理作以解釋，因此本實(shí)驗(yàn)未利用Western blot驗(yàn)證兩基因的蛋白水平上的變化，我們正通過(guò)其它分子生物學(xué)方法研究?jī)苫虻恼{(diào)控機(jī)理，這將在后續(xù)研究結(jié)果中加以報(bào)道。

4 結(jié)論

NNK能降低NCTC 1469細(xì)胞存活率，并誘導(dǎo)其凋亡，且通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的相對(duì)表達(dá)量誘導(dǎo)其凋亡，具體機(jī)制及與其它凋亡信號(hào)通路的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Toxic Effects of NNK on NCTC 1469 Cells

Han Yawei Wang Xihua Chen Liping Shi Guiqin Sun Liping Zhou Wenshan
（College of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450001）

This work is to investigate the cytotoxicity in NCTC 1469 cells induced by 4-（methyInitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone（NNK）. MTT assay was used to analyze the toxic effects on NCTC 1469 cells under various concentrations（0.1， 0.2， 0.3， 0.4， and 0.5 mg/mL）of NNK at different times. Morphologic changes of treated NCTC 1469 cells with NNK were observed by the inverted microscopy. Flow cytometry（FCM）and real-time quantitative PCR were applied to measure the apoptosis rate and the expression of apoptotic gene Bcl-2 and Bax mRNA. NNK depressed the viability of NCTC 1469 cells with a pattern of the dose-dependent and time-dependent. Typical morphological changes of cells shrinkage and the decrease of density were observed by the inverted microscopy. FCW revealed that inhibited cell proliferation and induced death were of dose-dependent， i.e.， apoptotic rates were（16.79 ± 2.01）%， （26.87 ± 1.67）%， （41.78 ± 3.19）%， （50.89 ± 3.94）% and（65.86 ± 4.54）% respectively at 24 h after the cells treated with the concentrations（0.1， 0.2， 0.3， 0.4， and 0.5 mg/mL）of NNK， showing much higher than the control of（7.46 ± 1.58）%. Real-time quantitative PCR showed that with the raising of NNH concentration， the expression of gene Bcl-2 decreased and the expression of gene Bax gradually increased. Conclusively， NNK could obviously abate the viability of NCTC 1469 cells and induce the apoptosis of NCTC 1469 cells in a pattern of dose-dependent and time-dependent.

NNK；NCTC 1469 cells；apoptosis；flow cytometry

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.031

2015-01-09

鄭州市科技局科技攻關(guān)項(xiàng)目（121PPTGG362-16），河南省教育廳青年骨干教師項(xiàng)目（2012GG-117）

王西華，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：13673615603@163.com

韓亞偉，男，博士，副教授，研究方向：煙草分子毒理評(píng)價(jià)；E-mail：opsar@163.com