健膝丸對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎SOD、MDA、NO的影響

趙幸熬　婁玉鈐　張廣輝　李堅

【摘 要】目的：通過觀察健膝丸對膝骨關(guān)節(jié)炎模型SD大鼠血清SOD、MDA、NO表達水平的影響，以探求健膝丸在防治膝骨關(guān)節(jié)炎方面的作用機理，從而為本藥的臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)提供科學的理論依據(jù)，同時進一步探索骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制。方法：以40只雌性SD大鼠為實驗對象，隨機分為正常組、模型對照組、健膝丸組、抗骨增生膠囊組，每組10只。除正常組外，其余各組均采用改良Hulth法對大鼠進行造模。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素20萬U，1周后開始強迫大鼠每天活動0.5 h，連續(xù)8周。同時各組大鼠均采用灌胃給藥途徑給予相應(yīng)藥液，根據(jù)人與動物體表面積等效劑量折算出健膝丸組及抗骨增生膠囊組灌胃給藥量。正常組及模型對照組給予質(zhì)量濃度0.9%的生理鹽水，連續(xù)8周。8周后分別抽取各組大鼠腹腔靜脈血，離心后取上清，按照SOD、MDA、NO測試盒說明操作，用754分光光度計測各管吸光度（OD值），從而進一步計算出各組血清中的各指標的含量。結(jié)果：血清中SOD、MDA、NO含量測定結(jié)果顯示，模型對照組與正常組比較，模型對照組血清中SOD活性顯著下降（P < 0.01），MDA、NO含量顯著升高（P < 0.01）。健膝丸組與正常組比較，SOD活性差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），MDA及NO含量差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。健膝丸組與模型對照組比較，SOD活性顯著升高（P < 0.01），MDA含量差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）、NO含量顯著下降（P < 0.01）。對SOD、MDA、NO含量的影響，健膝丸組與抗骨增生膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義

（P > 0.05）。結(jié)論：通過對實驗各組SD大鼠血清中SOD、MDA、NO水平的檢測，結(jié)果顯示，在膝骨關(guān)節(jié)炎模型SD大鼠血清中， SOD活性下降，MDA及NO含量升高，由此可知氧自由基等因子在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病及軟骨細胞的破壞進程中起到重要作用。健膝丸對血清MDA的含量影響不明顯，但可顯著提高SOD活性、清除體內(nèi)過量的氧自由基，同時抑制了NO的過度產(chǎn)生、降低其生物效應(yīng)，改善關(guān)節(jié)微循環(huán)、保護軟骨細胞或促使受損細胞的修復，從而起到延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；健膝丸；軟骨細胞；血清SOD；血清MDA；血清NO；大鼠

健膝丸是全國名老中醫(yī)婁多峰教授治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的經(jīng)驗方，經(jīng)長期的臨床運用及觀察發(fā)現(xiàn)，健膝丸可減少大鼠骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）軟骨Ⅱ型膠原和蛋白多糖丟失，減輕關(guān)節(jié)軟骨破壞，減緩軟骨下骨硬化，延緩OA的發(fā)展進程[1]。本實驗采用復制KOA實驗動物模型的方法，從觀察血清生化指標的角度入手，深入研究健膝丸治療KOA的作用機制。

1 實驗材料

1.1 供試品 健膝丸（藥物組成：制首烏、淫羊藿、千年健、海桐皮、雞血藤、川牛膝、木瓜等），每1 g藥片含原生藥3.017 g，河南風濕病醫(yī)院院內(nèi)制劑，豫藥制字Z04010008。

1.2 對照品 抗骨增生膠囊（藥物組成：熟地黃、雞血藤、肉蓯蓉、萊菔子、狗脊、骨碎補、女貞子、牛膝、淫羊藿等），江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z10980006。

1.3 實驗動物 40只雌性健康4月齡SD大鼠，清潔級，空腹體質(zhì)量200～220 g，購自鄭州大學實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號0003224。

1.4 主要儀器 754分光光度計，上海第三分析儀器廠生產(chǎn)；FA104 型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)；SHH1WH-420型高效三用恒溫水箱，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；TDZ42WS低速自動平衡離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn)。

1.5 主要試劑 注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，批號E0910401；硫化鈉，天津市德恩化學試劑有限公司，批號20080102；戊巴比妥鈉，上海西唐生物科技公司，批號20080615；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒，南京建成生物工程研究所，批號20090626；丙二醛（MDA）測試盒，南京建成生物工程研究所，批號20090626；一氧化氮（NO）測試盒，南京建成生物工程研究所，批號20090626。

2 方 法

2.1 動物分組 SD大鼠在自然光照、自由進食水、常溫條件下飼養(yǎng)，以適應(yīng)環(huán)境。1周后稱重，采用區(qū)組隨機法將大鼠分為正常組、模型對照組、健膝丸組、抗骨增生膠囊組，每組10只。

2.2 造模方法 正常組給予假手術(shù)處理，僅打開關(guān)節(jié)腔，不損傷韌帶和半月板，縫合皮膚，無菌輔料包扎。其余各組均采用改良Hulth法進行手術(shù)造模。術(shù)前1 d用質(zhì)量濃度8%硫化鈉水溶液對各組大鼠右下肢進行脫毛，術(shù)前用質(zhì)量濃度2%戊巴比妥鈉對大鼠行腹腔注射以麻醉。麻醉成功后，各大鼠右膝常規(guī)消毒、鋪無菌巾，取大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)為手術(shù)入路，范圍長約1 cm，在顯微鏡下切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前后交叉韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，行抽屜試驗檢查，呈陽性后，無菌敷料包扎，手術(shù)結(jié)束。術(shù)后傷肢不進行固定，使其自由活動。術(shù)后各組大鼠，行抗感染治療，肌肉注射青霉素20萬U，連續(xù)3 d，以預(yù)防感染。1周后開始強迫大鼠活動，每日1次，每次0.5 h，連續(xù)8周。

2.3 藥物配制及給藥 術(shù)后1周，在造模的同時，開始給藥。根據(jù)人與動物體表面積等效劑量折算，抗骨增生膠囊用質(zhì)量濃度0.9%生理鹽水加熱配成

0.472 5 g·kg-1的溶液（臨床常用量），健膝丸用質(zhì)量濃度0.9%生理鹽水加熱配成1.35 g·kg-1的溶液，相當于原藥15 g（臨床常用量）。用藥各組灌胃給予相應(yīng)藥液，正常組和模型對照組則按1 mL·（100 g）-1

給予等體積質(zhì)量濃度0.9%生理鹽水灌胃給藥，每日1次，連續(xù)8周。

2.4 標本的采集與制備 8周后，分別麻醉各組動物后置于手術(shù)臺，仰臥位，腹壁消毒，鋪無菌巾。腹中部切開，取腹腔靜脈血5 mL，靜置2 h后放入離心機3 000 r·min-1離心5 min，取上清，置-20 ℃

冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 實驗指標的檢測

2.5.1 754分光光度計的使用 用754分光光度計，在相應(yīng)波長下測各管吸光度值（OD值）。

2.5.2 SOD的測定 用黃嘌呤氧化酶法，操作按其說明書進行。每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位（U），總SOD活力含量（U·mL-1）=（對照管吸光度-測定管吸光度）/（對照管吸光度）/ 50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

2.5.3 MDA的測定 用TBA（硫代巴比妥酸）法，操作按其說明書進行。MDA含量（nmol·mL-1）=

（測定管吸光度-測定空白管吸光度）/（標準管吸光度-標準空白管吸光度）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

2.5.4 NO的測定 用硝酸還原酶法，操作按其說明書進行。NO含量（?mol·L-1）=（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 各健膝丸組SD大鼠例數(shù)說明 在實驗過程中，正常組、抗骨增生膠囊組大鼠因灌胃操作失誤分別死亡2只、1只。因術(shù)后傷口感染嚴重，模型對照組剔除2只，健膝丸組及抗骨增生膠囊組各剔除1只。

3.2 血清中SOD、MDA、NO的含量測定 模型對照組與正常組比較，模型對照組血清中SOD活性顯著下降（P < 0.01），MDA、NO含量顯著升高

（P < 0.01）；健膝丸組與正常組比較，SOD活性差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），MDA及NO含量差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。健膝丸組與模型對照組比較，SOD活性顯著升高（P < 0.01），MDA含量差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），NO含量顯著下降（P < 0.01）。健膝丸組與抗骨增生膠囊組比較，對SOD、MDA、NO含量的影響，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

4 討 論

現(xiàn)代西醫(yī)學認為，OA的病變中心是軟骨損傷。成熟軟骨由軟骨細胞及其分泌的細胞外基質(zhì)共同組成，在力學因素和生物學因素的共同作用下，軟骨細胞、細胞外基質(zhì)和軟骨下骨三者間分解和合成代謝失衡導致了OA的發(fā)生，而這一失衡又是炎性介質(zhì)、基質(zhì)成分經(jīng)與特殊受體結(jié)合傳遞信號進入細胞核，激活基質(zhì)金屬蛋白酶和炎性基因的轉(zhuǎn)錄，使關(guān)節(jié)細胞激活的結(jié)果[2-4]。在OA病理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)滑液、滑膜以及軟骨細胞釋放大量炎性介質(zhì)及活性因子，它們之間的平衡與否決定著軟骨細胞的損傷程度[5]。這些因子大致可分為3個亞型，在促分解性細胞因子中，主要有白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-1α（IL-1α）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。在OA病理狀態(tài)下，體內(nèi)IL-1α、IL-1β均升高，其不僅可以促進纖溶酶活性使軟骨及基質(zhì)受到破壞，還可以通過白細胞介素-6（IL-6）和內(nèi)源性NO的介導抑制蛋白聚糖的合成及軟骨細胞的增殖。TNF-α通過增加間質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性來抑制基質(zhì)中糖蛋白和膠原的合成，加速軟骨基質(zhì)的分解代謝。白細胞介素及腫瘤壞死因子不僅可使基質(zhì)破壞，而且還可抑制其修復，增加二者任何一種都能導致顯著的軟骨和軟骨下骨的退變。調(diào)節(jié)性細胞因子IL-6在OA的病變中起到既促進分解，又幫助修復和再生的雙重作用[6]。與OA關(guān)系最密切的自由基代謝，是活性氧（ROS）的代謝，主要是超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧4種。在OA病理狀態(tài)下，氧自由基含量增高，過量的氧自由基抑制軟骨細胞的增殖，促進其凋亡；加速軟骨基質(zhì)的降解、抑制其合成，從而導致軟骨的損傷。體內(nèi)存在的清除氧自由基的天然酶系統(tǒng)，主要有SOD，過氧化氫酶（Cat）和谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px），后兩者清除氧自由基的前體或脂質(zhì)過氧化物。SOD與MDA常作為配對指標，用以檢測機體血氧自由基的水平，SOD活力的高低間接反映機體清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，二者可作為動態(tài)評價OA防治效果的客觀指標。NO在OA發(fā)病過程中是重要的炎癥介質(zhì)，高濃度的NO能抑制軟骨細胞增殖，通過多條途徑誘導軟骨細胞凋亡，能抑制軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)，導致軟骨組織破壞，促使OA的病理進展。軟骨細胞的凋亡與NO水平的升高相關(guān)，抑制NO的產(chǎn)生，可抑制凋亡的產(chǎn)生[7]。

本課題通過實驗研究，初步觀察到健膝丸對OA血清中SOD、MDA、NO含量的影響表現(xiàn)出一定差異。健膝丸組與正常組比較，SOD活性無明顯差異，MDA及NO的含量有一定差異。健膝丸組與模型對照組比較，SOD活性顯著升高，NO含量明顯下降，MDA含量無明顯差異。由此可知，健膝丸可顯著提高血清中SOD的活性，降低血清中NO的含量，對血清中MDA的含量無明顯影響，從而起到延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用。

健膝丸以“虛邪瘀”理論為基礎(chǔ)，同時結(jié)合“祛邪不傷正，扶正不助邪”的治療原則[8]組方。方中制首烏性苦溫，功善補肝腎、益精血；淫羊藿辛甘性溫燥烈，長于補腎壯陽，散寒祛風勝濕；千年健辛散苦燥溫通，既能入肝腎強筋骨，又可祛風逐痹；海桐皮辛散苦燥，功善祛風濕、通經(jīng)絡(luò)、止疼痛；雞血藤性苦溫，具有行血養(yǎng)血，舒筋活絡(luò)之效；川牛膝性苦酸，不但補益肝腎、強筋健骨，而且活血祛瘀通絡(luò)；木瓜性酸溫，善舒筋活絡(luò)，且能祛濕除痹。此方組方嚴謹，配伍精當，方義明確，攻補兼施，以達補益肝腎、強筋健骨、祛風除濕、活血通絡(luò)止痛之功效。同時現(xiàn)代藥理學證實，首烏中二苯乙烯苷、白藜蘆醇苷有提高SOD和過氧化氫酶活性的功能；加之首烏多糖可以提高體內(nèi)抗氧化酶活性，清除氧自由基及抑制脂質(zhì)過氧化，從而消除自由基對機體的損傷[9]。淫羊藿對人及動物的非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫均具有良好的促進作用，并表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)效果[10]。雞血藤具有調(diào)節(jié)免疫功能，采用DPPH法研究還發(fā)現(xiàn)其具有很強的抗氧化活性[11]。牛膝具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，可增強體液免疫及非特異性免疫；以牛膝煎液灌服小鼠30 d，結(jié)果顯示，牛膝煎液可顯著提高小鼠體內(nèi)SOD活性，降低血漿脂質(zhì)過氧化物（LPO）的含量[12]。

木瓜中的齊墩果酸具有抗衰老、抗突變、清除自由基的作用；木瓜中的黃酮類物質(zhì)可以有效清除氧自由基，防止生物膜脂質(zhì)被超（下轉(zhuǎn)第49頁）

（上接第40頁）氧自由基和羥自由基氧化；木瓜中的有機酸不但可以抗腫瘤而且具有鎮(zhèn)痛的作用，木瓜多糖具有抗感染、御放射、抗衰老等作用，是理想的免疫增強劑[13]。千年健富含揮發(fā)油，其甲醇提取物具有顯著的鎮(zhèn)痛及抗炎效果。

綜上所述，健膝丸能提高機體免疫功能，改善局部微循環(huán)，促進炎性物質(zhì)的吸收，能提高機體內(nèi)SOD的活性，清除過多的超氧自由基從而避免超氧自由基及其代謝產(chǎn)物對機體的損傷；抑制炎癥因子NO的過量釋放，從而抑制軟骨細胞的凋亡水平，促進了軟骨細胞增殖與軟骨基質(zhì)的合成，從而保護了軟骨細胞，延緩了關(guān)節(jié)軟骨退變的進展。雖然從統(tǒng)計學分析，健膝丸對血清中MDA含量的影響無意義，但是從數(shù)據(jù)上看，健膝丸組還是低于模型對照組，其具體作用機制及對其他細胞因子的影響，還需進一步研究。

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