抗生素對辣椒外植體愈傷組織誘導的影響

金典生　魏理　張慶琛

摘要：以辣椒（Capsicun annuum L.）子葉和下胚軸為外植體，考察卡那霉素和羧芐青霉素對辣椒愈傷組織誘導和不定芽分化的影響。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中抗生素濃度的提高，辣椒外植體愈傷組織的誘導率逐漸降低，褐化率升高。和卡那霉素相比，羧芐青霉素的影響稍弱，其濃度為500 mg/L時外植體愈傷組織誘導情況仍較好。此外，與下胚軸相比，子葉分化形成不定芽的頻率更高。

關(guān)鍵詞：辣椒（Capsicun annuum L.）；外植體；愈傷組織；抗生素

中圖分類號：S641.3；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2185-03

辣椒（Capsicun annuum L.），又名番椒、海椒、青椒、椒子、秦椒等，屬雙子葉植物綱茄目茄科辣椒屬植物。辣椒含有人體必需的碳水化合物、蛋白質(zhì)以及各種維生素等，具有很高的營養(yǎng)價值，一直深受人們的喜愛，在世界各地廣泛栽培[1]。多年來一直困擾辣椒生產(chǎn)的一個主要問題是其容易受病菌的侵染，導致產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。通過常規(guī)的育種手段從現(xiàn)有品種中篩選出高抗、優(yōu)質(zhì)的品種難度大、耗時長，而且會造成作物遺傳多樣性的下降和有益基因的流失[2]。生物技術(shù)的快速發(fā)展，特別是基因工程的迅速興起，使人們能定向地將一些抗病蟲害的基因?qū)朕r(nóng)作物，改良物種[3]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在辣椒品種培育中的應用得到了飛速發(fā)展，其中應用最廣泛的是根癌農(nóng)桿菌介導法，它具有轉(zhuǎn)化方法簡單、效率高和拷貝數(shù)少等優(yōu)點，因而倍受人們關(guān)注[4]。在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化中，篩選培養(yǎng)基中往往要添加抗生素用于抑制農(nóng)桿菌和作為抗性選擇標記。由于不同種類的抗生素對農(nóng)桿菌菌株的抑制效果不同，不同作物的外植體對抗生素的反應也存在差異，而且有的抗生素在使用中表現(xiàn)出植物激素類似物的效應，影響植物組織的生長和分化[5]。所以，在辣椒進行基因轉(zhuǎn)化之前，研究抗生素對辣椒愈傷組織誘導和生長的影響，確定合適的抗生素及適宜的濃度，對于更好地從事辣椒轉(zhuǎn)基因研究至關(guān)重要。本研究選用了卡那霉素（Kanamycin）和羧芐青霉素（Carbenicilin）2種抗生素，探討其對辣椒愈傷組織誘導和生長的影響，以期為提高辣椒基因轉(zhuǎn)化效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒種子購自北京中良信農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司。卡那霉素和羧芐青霉素均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 辣椒無菌苗的獲得 選取新鮮飽滿的辣椒種子經(jīng)滅菌水浸泡10 min，70%（體積分數(shù)）的乙醇消毒30 s，滅菌水漂洗3次（2～3 min/次），0.1 g/mL的次氯酸鈉浸泡15 min，滅菌水漂洗5～6次（2～3 min/次），轉(zhuǎn)入無菌的培養(yǎng)皿濾紙上將水分吸干[6]。取經(jīng)無菌處理過的辣椒種子，在超凈工作臺上將其轉(zhuǎn)入經(jīng)高溫滅菌過的種子培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基約10粒種子，然后于25 ℃、光照條件下培養(yǎng)14 d左右至兩片子葉完全展開而未長出真葉[7]。

1.2.2 不定芽的誘導及繼代培養(yǎng) 取無菌培養(yǎng)的辣椒幼苗，在超凈工作臺上將其子葉切成0.5 cm×0.5 cm的片狀，下胚軸剪切成長0.5 cm左右的小段，分別接種于篩選培養(yǎng)基上，在25 ℃、光照條件下培養(yǎng)，3周后觀察其愈傷組織誘導率和褐化率。

1.2.3 培養(yǎng)基 ①種子培養(yǎng)基。MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0）。②誘導培養(yǎng)基。MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0）。③篩選培養(yǎng)基。MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0），附加不同濃度的卡那霉素（0、10、20、30、50 mg/L）或羧芐青霉素（0、200、300、400、500 mg/L）。④伸長培養(yǎng)基。MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素及濃度對辣椒愈傷組織誘導的影響

以辣椒無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，接種于含不同濃度抗生素的培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，3周后統(tǒng)計愈傷組織誘導率和外植體褐化率，結(jié)果見表1。由表1可知，在沒有添加任何抗生素的對照培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導率達到92.00%以上。愈傷組織誘導率隨著培養(yǎng)基中抗生素羧芐青霉素和卡那霉素濃度的升高而下降，并且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。羧芐青霉素對愈傷組織誘導的影響較小，其在培養(yǎng)基中的濃度升高到500 mg/L時辣椒外植體的愈傷組織誘導率仍較高，達到84.00%，且褐化率較低，僅為4.00%。而卡那霉素對愈傷組織的誘導有較強的抑制作用，誘導率隨其濃度的升高迅速下降，卡那霉素濃度僅為10 mg/L時誘導率即下降至75.00%，褐化率則隨其濃度的升高不斷升高，卡那霉素濃度為50 mg/L時褐化率高達28.57%。

2.2 外植體類型對愈傷組織誘導和不定芽分化的影響

本實驗取兩周左右苗齡的辣椒子葉和下胚軸作為外植體來誘導愈傷組織。實驗過程中發(fā)現(xiàn)同等培養(yǎng)條件下，下胚軸經(jīng)愈傷組織誘導長出不定芽，而子葉可直接誘導出不定芽（圖1）。

3 討論

在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，要加入一定量的抗生素來抑制農(nóng)桿菌的生長和作為抗性選擇標記，但是抗生素對農(nóng)桿菌抑制的同時對植物組織的生長也有一定的影響，為減輕或消除這種影響，進行抗生素種類和濃度篩選的研究是必要的[8]。本實驗用辣椒無菌苗的子葉和下胚軸作為外植體，研究不同濃度羧芐青霉素和卡那霉素對辣椒愈傷組織誘導和生長的影響。結(jié)果表明，卡那霉素對辣椒外植體愈傷組織的生長產(chǎn)生抑制作用，并且抑制作用隨著卡那霉素濃度的升高而增強。相對而言羧芐青霉素對辣椒愈傷組織誘導的影響較小，且較低濃度的羧芐青霉素對辣椒愈傷組織的生長具有一定的促進作用，與張明洲等[9]的報道相似。

辣椒愈傷組織的誘導培養(yǎng)是辣椒離體組織培養(yǎng)體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選擇合適的外植體對獲得優(yōu)良的胚性愈傷組織及建立高效的離體再生體系至關(guān)重要。目前已有從辣椒子葉[10]、葉柄[11]、莖尖[12]、下胚軸[10]等各種外植體誘導出愈傷組織并形成再生植株的報道。本實驗采用辣椒無菌苗子葉和下胚軸作為外植體進行愈傷組織的誘導，結(jié)果表明在同等條件下下胚軸的出愈率較快，但子葉長出不定芽的頻率要比下胚軸高得多，這和朱昌叁等[13]、陳靜嫻等[14]的實驗結(jié)果相似，所以首選子葉作為辣椒組織培養(yǎng)的外植體。

本實驗在辣椒不定芽長到一定程度后將其轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基上，進行不定芽的伸長培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)和愈傷組織誘導階段相比，不定芽的長度伸長了，但是生長狀態(tài)并不理想，短期內(nèi)不能達到生根移栽的程度。有研究表明，基因型、苗齡、外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等都會對辣椒再生體系的建立產(chǎn)生一定的影響[10]，如何進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，促進辣椒不定芽的生長成苗還有待進一步研究。在進行組織培養(yǎng)時，很容易受到污染、褐化等影響導致實驗失敗，因此，實驗要嚴格在無菌條件下進行操作，控制溫度和培養(yǎng)基成分，并及時繼代培養(yǎng)，從而盡可能地降低褐化率。

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