酸棗仁ACE抑制肽酶解工藝優(yōu)化

譚力銘，曹 妍，裴海生，郝建雄, ，李慧穎

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北石家莊 050000；2.河北省功能食品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050000；3.衡水市衛(wèi)生健康委員會綜合監(jiān)督執(zhí)法局，河北衡水 053000；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計研究院，北京 100121）

酸棗仁（Ziziphus jujubaMill.var.spinosa）是將酸棗去除果核，從果核中分離得到種子即為酸棗仁[1]，華北地區(qū)、陜西、內(nèi)蒙古等地產(chǎn)量豐富。酸棗仁作為一種藥食同源食品，營養(yǎng)價值高，同時具有鎮(zhèn)靜、安神的作用[2]。

ACE即為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，而ACE抑制肽是一類可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的小分子肽段，ACE抑制肽具有安全、高效、易吸收等優(yōu)點。世界上第一種ACE抑制劑是從南美蝮蛇的毒液中得到[3]，而目前常見的降壓藥物如：卡托普利、賴諾普利等都是從蛇的毒液中獲取[4]。目前天然ACE抑制肽主要有動物來源和植物來源，已發(fā)現(xiàn)的具有ACE抑制作用的植物源如：大豆、豌豆、玉米、魔芋、核桃、大蒜、苦瓜種子等[5?12]；動物源如：蛋清、鰱魚、豬血紅等[13?15]。從植物中獲取的ACE抑制肽相較于動物中獲取的ACE抑制肽具有成本低、綠色可持續(xù)等優(yōu)點。近年來。從植物中獲取ACE抑制肽的相關(guān)研究一直是研究熱點。

目前ACE抑制肽的制備主要從酶法、化學合成法、DNA重組法來提取和合成ACE抑制肽[16]，根據(jù)不同蛋白種類采取不同制備方法，而植物來源蛋白大多采取酶法制備ACE抑制肽。酶法常見的蛋白酶如堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶、細菌蛋白酶、真菌蛋白酶等[17?18]，而酶的種類、溫度、酶解時間和酶添加量都是ACE抑制肽產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[19?20]。由于酶的特異性，不同酶的共同作用也會使ACE抑制能力有著不同程度的增強[21?22]。Sari等[23]以脫脂菜籽粕為原料通過堿性蛋白酶制備ACE抑制肽，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解產(chǎn)物中的ACE抑制肽在人體胃液和十二指腸液的體外消化模型中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；Pihlanto等[24]通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶酶解不同生理狀態(tài)的馬鈴薯塊莖中分離蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物具有較強的ACE抑制作用和自由基清除活性；徐敏等[25]通過堿性蛋白酶復合中性蛋白酶來酶解米渣蛋白，制備ACE抑制肽。

現(xiàn)階段，關(guān)于酸棗仁的研究主要集中于酸棗仁皂苷、酸棗仁黃酮等方面[26]，關(guān)于酸棗仁蛋白的研究較少，針對酸棗仁蛋白的生物活性研究集中在抗氧化方面，較為單一。在酶解方面，目前酸棗仁蛋白酶解僅局限于單一種類酶，且關(guān)于酸棗仁蛋白ACE抑制肽的研究鮮有報道。本文對酸棗仁蛋白進行復合酶解，篩選復合酶種類，并對復合酶添加比例、酶解溫度、底物濃度、pH、酶解時間進行單因素實驗，在此基礎(chǔ)上進行響應面研究，以ACE抑制率、水解度DH為指標，優(yōu)化酸棗仁蛋白酶解工藝參數(shù)，旨在為酸棗仁蛋白酶解加工奠定一定的理論基礎(chǔ)，為酸棗仁副產(chǎn)物再利用提供一個新的開發(fā)方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁渣 河北省邢臺市潤玉食品有限公司提供；堿性蛋白酶（20000 U/g）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、卡托普利 生化純，北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶（5000 U/g）、胃蛋白酶（3000 U/g）、胰蛋白酶（250000 U/g）、木瓜蛋白酶（100000 U/g）、α-糜蛋白酶（1200000 U/g） 生化純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；馬脲酰-組氨酸-亮氨酸 生化純，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、硼砂 分析純，天津市永大化學試劑有限公司；氯化鈉、硼酸 分析純，天津博迪化工股份有限公司；乙酸乙酯 分析純，天津歐博凱化工有限公司；石油醚 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；HC-3018高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；RT-25型氣流式超微粉碎機 榮聰精密科技有限公司；LGJ-10D型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；SPECTRO star Nano酶標儀 德國BMG LABTECH公司；MC-ACPH-30ApH自動控制儀計 北京滿倉科技有限公司；J09626石英96孔板 上海百千生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗仁蛋白的制備 參考趙節(jié)昌[27]的方法，略有改進。取200 g酸棗仁渣以液氮為冷源通入粉碎機，打粉1 min，過80目篩。將粗粉碎的酸棗仁渣放入氣流式超微粉碎機，以液氮為冷源通入超微粉碎機，電流設(shè)置5 A，粉碎1 min，過150目篩，收集密封放入4 ℃冰箱備用。

將粉碎好的酸棗仁粉與石油醚按料液比1:3 g/mL，50 ℃水浴浸提30 min，4 ℃離心（4000 r/min、10 min）去除上清液，重復多次，直到上清液完全澄清透明，室溫通風12 h，40 ℃干燥12 h，得到脫脂酸棗仁粉，收集密封放入?20 ℃冰箱備用。

稱取1 g脫脂酸棗仁粉，按液料比32:1（mL/g）溶解于蒸餾水中，用1 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH為11.4，51 ℃下水浴攪拌浸提58 min，4 ℃離心（5000 r/min、20 min）得上清液，用1 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至酸棗仁蛋白等電點即pH4.6，4 ℃靜置2 h，4 ℃離心（5000 r/min、15 min）得到酸棗仁蛋白沉淀，冷凍干燥得到酸棗仁蛋白粉。

1.2.2 酸棗仁蛋白酶解液的制備 稱取1 g凍干后酸棗仁蛋白粉，按比例溶解于蒸餾水中，加入一定量的蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH，在一定溫度下水浴攪拌浸提一定時間，酶解過程中保持酶解液pH、溫度不變。酶解結(jié)束后滅酶活，沸水浴10 min，待酶解液冷卻至室溫后置于?20 ℃冰箱備用。

1.2.3 復合酶篩選 選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解酸棗仁蛋白，考察不同蛋白酶對ACE抑制率和水解度的影響，各蛋白酶酶解條件見表1。篩選得到最優(yōu)的兩種酶，為了確定復合酶與單一酶對ACE抑制率和水解度的影響，選擇將這兩種酶按1:1比例復合，測定單一酶與復合酶對ACE抑制率和水解度的影響，后續(xù)再測定復合酶的具體比例。

表1 6種蛋白酶酶解條件Table 1 Conditions for enzymatic hydrolysis of six proteases

1.2.4 單因素實驗 考察酸棗仁蛋白酶解過程中加酶量、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的添加比例、酶解溫度、底物濃度、pH、酶解時間，六種因素對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響，并設(shè)置重復試驗。

1.2.4.1 酶添加量對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率和水解度的影響 以酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度為測量指標。中性蛋白酶的酶解條件確定為：酶解溫度為55 ℃，底物濃度為3%，pH為7.0，酶解時間為60 min，加酶量分別設(shè)定為4000、5000、6000、7000、8000 U/g；堿性蛋白酶的酶解條件確定為：酶解溫度為55 ℃，底物濃度為3%，pH為7.0，酶解時間為60 min，加酶量分別設(shè)定為4000、5000、6000、7000、8000 U/g?？疾靸烧吒髯缘拿柑砑恿繉λ釛椚实鞍酌附猱a(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.4.2 中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率和水解度的影響 以酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度為測量指標，酶解條件確定為：以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為復合酶，復合酶加酶量為6000 U/g，酶解溫度為55 ℃，底物濃度為3%，pH為7.0，酶解時間為60 min，中性蛋白酶和堿性蛋白酶比例分別設(shè)定為1:3、1:2、1:1、2:1、3:1，考察中性蛋白酶和堿性蛋白酶添加比例對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.4.3 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響 以酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度為測量指標，固定條件為中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為1:1，加酶量為6000 U/g?？疾烀附鉁囟葘λ釛椚实鞍酌附猱a(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響。按底物濃度為3%，pH為7.0，酶解時間為60 min，酶解溫度分別設(shè)定為45、50、55、60、65 ℃試驗。

1.2.4.4 底物濃度對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響 以酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度為測量指標，固定條件為中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為1:1，加酶量為6000 U/g。考察底物濃度對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響。按酶解溫度為55 ℃，pH為7.0，酶解時間為60 min，底物濃度分別設(shè)定為2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%試驗。

1.2.4.5 pH對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響 以酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度為測量指標，固定條件為中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為1:1，加酶量為6000 U/g?？疾靝H對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響。按酶解溫度為55 ℃，酶解時間為60 min，pH分別設(shè)定為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0試驗。

1.2.4.6 酶解時間對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響 以酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度為測量指標，固定條件為中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為1:1，加酶量為6000 U/g?？疾烀附鈺r間對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響。按底物濃度為3%，酶解溫度為55 ℃，pH為7.0，酶解時間分別設(shè)定為40、50、60、70、80 min試驗。

1.2.5 響應面試驗 基于單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken原理設(shè)計試驗方案，以中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例（A）、酶解溫度（B）、底物濃度（C）、pH（D）、酶解時間（E）為影響因素，ACE抑制率（R1）、水解度DH（R2）為響應值，試驗因素水平見表2。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

1.2.6 ACE抑制率測定 采用Cushman等[28]測定方法，略有改進。配制0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH8.3，含0.3 mol/L氯化鈉）：稱取12.37 g硼酸溶于1 L去離子水中即為0.2 mol/L硼酸溶液；稱取19.07 g硼砂溶于1 L去離子水中即為0.05 mol/L硼砂溶液；量取175 mL硼砂溶液和352 mL硼酸溶液混溶，加入17.532 g氯化鈉，用1 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至8.3，同時用1 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為8.3的去離子水定容至1 L，保證溶液pH的穩(wěn)定。

馬脲酰-組氨酸-亮氨酸（HHL）溶液配制：稱取一定量HHL溶于硼酸鹽緩沖溶液，配制成5 mg/mL的HHL溶液。取1 mL該濃度的HHL溶液，溶于1.4 mL硼酸鹽緩沖溶液，配制成5 mmol/L的HHL溶液。

ACE抑制率測定步驟見表3，按表3中順序和劑量依次加入試劑，在37 ℃恒溫水浴鍋水浴5 min后，加入一定量的ACE溶液混勻，再置于37 ℃恒溫水浴鍋水浴40 min，后加入50 μL、1 mol/L鹽酸溶液使反應停止。隨后加入0.9 mL乙酸乙酯，振蕩混勻后靜置，量取0.5 mL乙酸乙酯層液體置于1.5 mL離心管中，放置于100 ℃烘箱中充分揮發(fā)30 min。取出冷卻至室溫，加入1 mL去離子水，振蕩混勻，每個孔打200 μL于石英96孔板中，用酶標儀測量228 nm波長下的吸光度值。ACE抑制率計算：

表3 ACE抑制率測定步驟Table 3 Test procedure of ACE inhibition rate

式中：A1表示加入ACE和酶解液的吸光度值；A2表示不加酶解液的吸光度值；A3表示加入鹽酸使ACE失活后，加入酶解液的吸光度值。

1.2.7 水解度（DH）的測定 采用Adlernissen[29]的pH-stat法測定酸棗仁蛋白酶解液的水解度，略有改動。利用pH自動控制儀調(diào)節(jié)酶解過程中酶解液的pH變化，統(tǒng)計堿液消耗量，計算水解度。計算公式為：

式中：V表示消耗的堿液體積，L；C表示堿液濃度，mol/L；α表示氨基平均解離度；M表示酸棗仁蛋白質(zhì)量，g；htot表示酸棗仁蛋白肽鍵含量，mol/g。

1.2.8 ACE抑制作用實驗 樣品組為最優(yōu)條件下酸棗仁蛋白酶解液，酶解前底物濃度為3%。陽性對照組為卡托普利，對照組濃度為3%。分別進行ACE抑制率實驗，對比兩組ACE抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次，試驗結(jié)果用平均值±標準差表示，使用OriginPro8.0、SPSS Statistics22.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合酶篩選結(jié)果

分別利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解酸棗仁蛋白，得到六種酶解液，測定各酶解液的ACE抑制率及水解度，測定結(jié)果如圖1~圖3所示。

圖1 不同蛋白酶對ACE抑制率影響Fig.1 Effects of different proteases on ACE inhibition rate

由于不同蛋白酶對肽鏈的剪切位點不同，具有特異性，導致酶解得到的小分子肽段的分子量大小、分子量分布、極性基團、氨基酸組成都存在差異，進而功能性存在差異。由圖1可知，對比六種蛋白酶對ACE抑制率的影響，發(fā)現(xiàn)使用中性蛋白酶后，其ACE抑制率最高且為（73.91%±1.26%），中性蛋白酶與其他蛋白酶的酶解產(chǎn)物的ACE抑制率方面存在顯著性差異（P<0.05），其次是使用堿性蛋白酶后的ACE抑制率大小為（64.75%±1.21%），僅次于中性蛋白酶，且與其余4種酶存在顯著性差異（P<0.05）。由圖2可知，對比六種蛋白酶對水解度的影響，發(fā)現(xiàn)使用中性蛋白酶后，其水解度最高且為（26.70%±1.43%），中性蛋白酶與其他蛋白酶的酶解產(chǎn)物的水解度存在顯著性差異（P<0.05），其次是使用堿性蛋白酶后的水解度為（22.29%±1.55%），僅次于中性蛋白酶，且與其余4種酶存在顯著性差異（P<0.05），ACE抑制率和水解度反映出不同蛋白酶存在特異性。由圖3可知，通過堿性蛋白酶、復合蛋白酶（中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為1:1）、中性蛋白酶分別酶解酸棗仁蛋白，比較其對ACE抑制率和水解度的影響，發(fā)現(xiàn)復合蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度的影響顯著（P<0.05）高于堿性蛋白酶和中性蛋白酶。綜合考慮，選擇復合酶即中性蛋白酶和堿性蛋白酶復合，進行后續(xù)酶比例的單因素試驗和酸棗仁蛋白制備ACE抑制肽酶解工藝優(yōu)化。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對ACE抑制率和水解度的影響 由圖4和圖5可知隨著中性蛋白酶和堿性蛋白酶的添加量增加，ACE抑制率和水解度隨之升高，在酶添加量分別為5000 U/g和6000 U/g時，ACE抑制率開始降低后趨于平緩，這是因為過量的中性蛋白酶開始分解具有ACE抑制活性的多肽，使其功能活性發(fā)生改變，ACE抑制率升高，但酶的結(jié)合位點具有特異性，酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合達到飽和狀態(tài)，使酶添加量繼續(xù)升高而趨于平緩。由于中性蛋白酶添加量為5000和6000 U/g時無明顯差異，所以在ACE抑制率方面選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶復合酶添加量同為6000 U/g。水解度在中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶添加量分別為6000和5000 U/g時則趨于平緩，且兩種酶添加量在6000、7000、8000 U/g不存在顯著性差異（P?0.05），推測是由于在6000 U/g時溶液里的酶達到飽和，再增加酶量只會提高酶解速率而不會提高水解程度，所以從實際生產(chǎn)成本考慮，在水解度方面選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適酶添加量為6000 U/g，綜合確定最適酶添加量為6000 U/g。由于水解度越高，說明酶解越充分，其主要酶解產(chǎn)物為3000 Da以下小分子蛋白含量越高，相關(guān)研究表明具備降壓效果的多肽分子量主要集中在1000~3000 Da[30?32]，所以ACE抑制率與水解度變化趨勢相近。

2.2.2 中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例對ACE抑制率和水解度的影響 由圖6可知，中性蛋白酶和堿性蛋白酶添加比例為2:1時，ACE抑制率和水解度最高且分別為（77.33%±1.37%）和（29.74%±0.92%），且與其他比例和單一酶解的ACE抑制率和水解度均存在顯著性差異。這是由于兩種蛋白酶分別作用于不同位點，且共同作用比單一作用所得到的酶解產(chǎn)物更為復雜，導致酶解產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)和生物活性改變，所以在ACE抑制率和水解度方面均有提高。故選擇復合酶添加比例即中性蛋白酶和堿性蛋白酶兩者的添加比例為2:1為最優(yōu)比例。

圖6 復合酶添加比例對ACE抑制率和水解度的影響Fig.6 Effects of compound enzyme addition ratio on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.3 酶解溫度對ACE抑制率和水解度的影響 由圖7可知，ACE抑制率和水解度隨著溫度的升高而增大，當溫度為55 ℃時，ACE抑制率和水解度分別達到最高，此時酶活達到最優(yōu)。后續(xù)ACE抑制率和水解度隨著溫度的升高而降低，這是由于溫度繼續(xù)升高，蛋白酶結(jié)構(gòu)遭到破壞而導致酶活減弱，且酶解產(chǎn)物的活性、穩(wěn)定性降低[33]，所以ACE抑制率和水解度隨之降低。故選擇最優(yōu)酶解溫度為55 ℃。

圖7 酶解溫度對ACE抑制率和水解度的影響Fig.7 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.4 底物濃度對ACE抑制率和水解度的影響 由圖8可知，ACE抑制率和水解度隨著底物濃度的升高而增大，當?shù)孜餄舛葹?%時兩者同時達到最高，隨后ACE抑制率和水解度隨著底物濃度的升高隨之下降，這是因為底物濃度過高導致體系黏度升高，從而使酶分子與底物擴散不充分，所以不利于酶解反應[34]。故選擇3%為最優(yōu)底物濃度。

圖8 底物濃度對ACE抑制率和水解度的影響Fig.8 Effects of substrate concentration on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.5 pH對ACE抑制率和水解度的影響 由圖9可知，ACE抑制率和水解度隨著pH的升高而增大，在pH為7.5時兩者同時達到最高，且此時酶活最高。后隨著pH的升高ACE抑制率和水解度也隨之降低，這是因為酶具有最適pH，不適pH會導致酶的空間結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，致使酶活降低，進而影響ACE抑制率和水解度。故選擇最優(yōu)pH為7.5。

圖9 pH對ACE抑制率和水解度的影響Fig.9 Effects of pH on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.6 酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響 由圖10可知，隨著酶解時間的增加，ACE抑制率和水解度逐漸升高，60 min后隨著酶解時間的增加，ACE抑制率和水解度逐漸趨于平緩。水解度的變化原因是因為酶解時間較短時，蛋白分子被分解為質(zhì)量分數(shù)較大的肽段，肽鍵快速斷裂，酶解速度較快，隨著酶解時間的增加，大分子的肽段被充分水解，剩余可水解的肽鍵數(shù)量減少，且底物與酶結(jié)合導致產(chǎn)生競爭性抑制作用[35]。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制率與時間的關(guān)系常常隨著水解度的變化而變化[36?38]。故選擇最優(yōu)酶解時間為60 min。

圖10 酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響Fig.10 Effects of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.3 響應面試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，確定5因素3水平的響應面分析方法，酸棗仁蛋白酶解響應面試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

2.3.1 ACE抑制率的回歸模型建立與方差分析 通過表4試驗數(shù)據(jù)，得到ACE抑制率（R1）的回歸方程：

表4 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Experimental design and results

R1=79.15+0.40A?2.10B+0.37C+0.61D+1.64E+0.50AB+0.25AC+1.34AD+0.26AE?1.08BC+0.13BD+0.56BE?0.088CD+0.14CE+0.32DE?2.96A2?6.59B2?3.13C2?4.78D2?4.02E2，該回歸方程的方差分析，結(jié)果見表5。

該模型的F=628.59，P<0.0001差異極顯著，且失擬項P=0.0720>0.05，不顯著，決定系數(shù)為0.9963，擬合度程度較高。由表5回歸模型系數(shù)的二次回歸分析，剔除不顯著項后得到的回歸方程為：

表5 ACE抑制率（R1）回歸模型方差分析Table 5 ACE inhibition rate (R1) regression model analysis of variance

分析對比一次項的F值，得出4個單因素對ACE抑制率影響大小順序為：B>E>D>A>C，即酶解溫度>酶解時間>pH>中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例>底物濃度。在交互項中，AB、AD、BC、BE的交互作用對ACE抑制率的影響極顯著（P<0.01），DE的交互作用對ACE抑制率的影響顯著（P<0.05），AC、AE、BD、CD、CE的交互作用對ACE抑制率的影響不顯著（P>0.05）。而對于模型的二次項來說均極顯著（P<0.01）。

2.3.2 ACE抑制率響應面分析 經(jīng)Deign-Expert11軟件處理，得到添加比例（A）、酶解溫度（B）、底物濃度（C）、pH（D）和酶解時間（E）交互作用的響應面圖。

由圖11可知，ACE抑制率隨著中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例、酶解溫度、底物濃度、pH、酶解時間的升高，ACE抑制率都出現(xiàn)先升高后減小的趨勢，可以推斷出獲得較高ACE抑制率，中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例應在2附近，酶解溫度應在（54~56 ℃）之間，底物濃度應在3%附近，pH應在7.4~7.6之間，酶解時間應在60 min附近。

如圖11所示，AB、AD、BC、BE交互作用下的等高線呈現(xiàn)曲線密集、較扁的橢圓形，且響應面的曲面降幅較大、走勢陡峭，即表示AB、AD、BC、BE的交互作用對ACE抑制率影響為極顯著（P<0.01）；相較之下，DE交互作用下的等高線則出現(xiàn)較規(guī)則橢圓形且曲線較稀疏，響應面圖傘形明顯但降幅較小，表示DE的交互作用對ACE抑制率影響為顯著（P<0.05），此都與方差分析結(jié)果吻合。

圖11 不同因素的交互作用對ACE抑制率影響的響應面圖Fig.11 Response surface map of the interaction of different factors on ACE inhibition rate

2.3.3 水解度的回歸模型建立與方差分析 通過表4試驗數(shù)據(jù)，得到水解度（R2）的回歸方程：

R2=31.24+0.28A?1.63B+0.25C+0.72D+0.73E+0.14AB+0.14AC+1.09AD?0.92AE?0.61BC+0.41BD?0.31BE+0.78CD?1.14CE+0.16DE?2.13A2?3.39B2?2.72C2?3.63D2?1.76E2，該回歸方程的方差分析，結(jié)果見表6。

該模型的F=266.02，P<0.0001差異極顯著，且失擬項P=0.0964>0.05，不顯著，決定系數(shù)為0.9936，擬合度程度較高。由表6回歸模型系數(shù)的二次回歸分析，剔除不顯著項后得到的回歸方程為：

表6 水解度（R2）回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of degree of hydrolysis (R2) regression model

續(xù)表 6

R2=31.24+0.28A?1.63B+0.25C+0.72D+0.73E+1.09AD?0.92AE?0.61BC+0.41BD?0.31BE+0.78CD?1.14CE?2.15A2?3.39B2?2.72C2?3.63D2?1.76E2

分析對比一次項的F值，得出5個單因素對ACE抑制率影響大小順序為：B>E>D>A>C，即酶解溫度>酶解時間>pH>中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例>底物濃度。在交互項中，AD、AE、BC、BD、CD、CE的交互作用對水解度的影響極顯著（P<0.01），BE的交互作用對ACE抑制率的影響顯著（P<0.05），AB、AC、DE的交互作用對ACE抑制率的影響不顯著（P>0.05）。而對于模型的二次項來說均極顯著（P<0.01）。

2.3.4 水解度抑制率響應面分析 經(jīng)Deign-Expert11軟件處理，得到添加比例（A）、酶解溫度（B）、底物濃度（C）、pH（D）和酶解時間（E）交互作用的響應面及等高線圖。

由圖12可知，水解度隨著中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例、酶解溫度、底物濃度、pH、酶解時間的升高，水解度都出現(xiàn)先升高后減小的趨勢，可以推斷出獲得較高水解度，中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例應在2附近，酶解溫度應在（54~56 ℃）之間，底物濃度應在3%附近，pH應在7.4~7.6之間，酶解時間應在60 min附近。

如圖12所示，AE、BC、BD、CD交互作用下的等高線呈較扁的橢圓形、曲線密集，AD、CE交互作用下的等高線的曲線中心較稀疏，但響應面降幅較大且走勢陡峭，表示AE、BC、BD、CD、AD、CE的交互作用對水解度影響為極顯著（P<0.01）；相較之下，BE交互作用下的等高線的曲線中心較稀疏且響應面降幅較小，表示BE的交互作用對水解度影響為顯著（P<0.05），此都與方差分析結(jié)果吻合。

圖12 不同因素的交互作用對水解度影響的響應面圖Fig.12 Response surface map of interaction of different factors on degree of hydrolysis

由所得到的模型，經(jīng)Design-Expert11軟件處理得到ACE抑制率和水解度最高的相應各參數(shù)值為：中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為2.06:1，酶解溫度為54.03 ℃，底物濃度為3.07%，pH為7.54，酶解時間為61.84 min，最大理論ACE抑制率為79.52%，最大理論水解度為31.54%。經(jīng)過修正確定最終工藝參數(shù)為液料比中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為2.1:1、酶解溫度為54 ℃，底物濃度為3.1%，pH為7.5，酶解時間為62 min。此條件下重復進行3次試驗，ACE平均抑制率為（79.46%±0.49%），平均水解度為（31.45%±0.85%），兩者與理論值接近，表明該回歸模型對優(yōu)化ACE抑制率和水解度的工藝可行，可用于指導實際生產(chǎn)。

2.4 ACE抑制作用實驗結(jié)果

樣品組在最優(yōu)酶解條件下，ACE抑制率大小為（79.46%±0.49%），而陽性對照組卡托普利的ACE抑制率大小為（98.74%±0.61%），雖然樣品組ACE抑制率低于陽性對照組，但證明酸棗仁ACE抑制肽具有顯著降壓效果（P<0.05）。由于本試驗中酸棗仁蛋白酶解液中為雜蛋白，未進行分離純化，所以不以多肽濃度定義，而是以酶解前底物濃度定義，同樣，本試驗對照卡托普利僅為定性試驗，具體定量還需后續(xù)體外試驗。

3 結(jié)論

通過測定六種蛋白酶與復合蛋白酶（中性蛋白酶:堿性蛋白酶為1:1）分別酶解酸棗仁蛋白得到的酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度，結(jié)果表明復合蛋白酶酶解后酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和水解度都顯著高于其它組，故確定中性蛋白酶和堿性蛋白酶作為復合蛋白酶來優(yōu)化酶解工藝。確定復合酶的酶添加量為6000 U/g。

經(jīng)Design-Expert11軟件分析得出5個因素對ACE抑制率和水解度影響由大到小的順序為：酶解溫度、酶解時間、pH、添加比例、底物濃度。由得到的回歸模型對酸棗仁蛋白酶解工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為中性蛋白酶/堿性蛋白酶比例為2.1:1、酶解溫度為54 ℃，底物濃度為3.1%，pH為7.5，酶解時間為62 min。此條件下進行3次驗證試驗，ACE平均抑制率為（79.46%±0.49%），平均水解度為（31.45%±0.85%），與理論值較為接近，表明該回歸模型對優(yōu)化酸棗仁蛋白酶解制備酸棗仁ACE抑制肽工藝可行，較前人的研究，補足了復合酶解酸棗仁蛋白制備ACE抑制肽的空白，為酸棗仁廢物再利用提供新的研究思路。在與卡托普利進行對比實驗中，側(cè)面證明酸棗仁ACE抑制肽具有顯著降壓效果，由于此對比試驗僅為定性試驗，若證明實際降壓效果，仍需開展后續(xù)動物試驗。