植物生長調(diào)節(jié)劑對內(nèi)生真菌生物合成鬼臼毒素的影響

李娟花

摘 要 目的 研究植物生長調(diào)節(jié)劑對G-2產(chǎn)鬼臼毒素的影響。方法 采用HPLC法檢測。結(jié)果 實驗表明6-芐氨基嘌呤（6-BA）濃度為4 mg/L、萘乙酸（NAA）濃度為4 mg/L、6-BA和NAA濃度比為3：5時該菌產(chǎn)鬼臼毒素的量分別為： 455.72 %eg/L、450.48 %eg/L、932.39 %eg/L，且6-BA和NAA對菌絲體的生長均有促進作用。

關(guān)鍵詞 植物生長調(diào)節(jié)劑 內(nèi)生真菌 生物合成 鬼臼毒素

藥用植物桃兒七是我國一級保護植物為小檗科鬼臼屬植物桃兒七的根及根狀莖，是我國特有種，主要分布于陜西、甘肅、青海、四川、云南、西藏等地，人工栽培尚未規(guī)?；?，藥材主要來源于野生，多年生草本植物，屬于“太白七藥”之一，具有良好的抗癌作用。其主要藥用成分是以鬼臼毒素為代表的木脂素類化合物，具有顯著的抗腫瘤活性以及治療尖銳濕疣和抑菌等作用。

目前用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)鬼臼毒素，是解決藥源問題的有效途徑。提高內(nèi)生菌產(chǎn)鬼臼毒素的產(chǎn)量是人們關(guān)注的熱點。有人發(fā)現(xiàn)將植物生長調(diào)節(jié)劑加入細胞培養(yǎng)物中可顯著提高細胞中鬼臼毒素的產(chǎn)量，但這些研究主要集中在細胞培養(yǎng)方面，將植物生長調(diào)節(jié)劑加入內(nèi)生真菌細胞發(fā)酵液中研究其對鬼臼毒素含量變化的影響國內(nèi)尚未見報道。本研究在內(nèi)生真菌發(fā)酵指數(shù)期加入植物生長調(diào)節(jié)劑，研究其對鬼臼毒素含量變化的影響，為提高鬼臼毒素的產(chǎn)量提供一種新的方法。

一、材料與方法

（一）材料

菌種 桃兒七內(nèi)生真菌G-2，由陜西國際商貿(mào)學(xué)院微生物實驗室提供。

培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0g， MgSO4 ·7H2O 3.0 g，KH2 PO4 5 .0g，VB 1 10.0mg，瓊脂粉12g，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g，葡萄糖40.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏0.8g，（NH4） 2SO4 3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1 10.0mg，水1000.0mL，pH自然。

設(shè)備 高效液相色譜儀；紫外檢測器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

（二）方法

液體發(fā)酵 挑取0.5 cm2活化菌種接到液體培養(yǎng)基中，28℃ 靜置培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌絲體生長至指數(shù)期時向發(fā)酵液中加入不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑進行培養(yǎng)。

分離提取 用布什漏斗抽濾過濾發(fā)酵液，菌絲球凍融（-20℃），菌液稱量體積。取菌液于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/10體積后，加入等體積的氯仿進行萃取，收集氯仿相；菌絲體烘干，放入研缽研磨至菌絲體完全破碎，然后加入一定量的氯仿超聲波提取3次，每次30min，收集氯仿相。合并氯仿相，并于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用無水乙醇溶解后定容至10ml，置4℃冰箱保存，備用。

分析檢測 標品用甲醇定容，配置成0.01-0.08 mg/mL的梯度，繪制標準曲線。色譜條件：色譜柱采用C18（4.6mm？50mm，5%em），紫外檢測波長290nm，流動相為：乙腈：水=45：55，設(shè)置流速為1ml/min。精密稱取鬼臼毒素標準品約2 mg，甲醇定容至10 mL，得母液濃度為0.2 mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL，取20 %eL進樣（N=4），得回歸方程為 y=6.0453+3726.3824x，r=0.9994建立標準曲線，采用外標法測定發(fā)酵產(chǎn)物抽提物中鬼臼毒素產(chǎn)量。

二、結(jié)果與分析

6-BA對G-2生物合成鬼臼毒素的影響

內(nèi)生真菌G-2液體發(fā)酵至7d時，加入不同濃度的6-BA，研究其對生物合成鬼臼毒素的影響。結(jié)果見圖1所示。

圖1表明，在使用6-BA誘導(dǎo)G-2生物合成鬼臼毒素時，鬼臼毒素的產(chǎn)量隨6-BA濃度的增大而增加。當6-BA的濃度達到4.0 mg/L時，鬼臼毒素產(chǎn)量達到峰值，即455.72 %eg/L。相比本底水平鬼臼毒素的產(chǎn)量增加不明顯。當6-BA濃度繼續(xù)增大，鬼臼毒素的產(chǎn)量隨之減小。結(jié)果表明，發(fā)酵液中6-BA濃度0～5.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，6-BA對鬼臼毒素的生物合成有促進作用，但影響不明顯，但6-BA的加入對菌絲體生長有促進作用。

NAA對G-2生物合成鬼臼毒素的影響

內(nèi)生真菌G-2液體發(fā)酵至7d時，加入不同濃度的NAA，添加范圍是0～5 mg/L，研究其對生物合成鬼臼毒素的影響。結(jié)果見圖2所示。

圖2表明，在使用NAA誘導(dǎo)G-2生物合成鬼臼毒素時，發(fā)酵液中鬼臼毒素的產(chǎn)量隨NAA濃度的增大而增加，當NAA的濃度達到4.0 mg/L時，鬼臼毒素的產(chǎn)量達到峰值，即450.48 %eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的產(chǎn)量增加不明顯。當NAA濃度繼續(xù)增大，發(fā)酵液中鬼臼毒素的產(chǎn)量隨之減小。結(jié)果表明，在NAA濃度0～5.0 mg/L范圍內(nèi)，NAA對鬼臼毒素的生物合成有促進作用，但影響不明顯，但NAA的加入對菌絲體生長有促進作用。

不同混合濃度6-BA 和NAA對G-2生物合成鬼臼毒素的影響

內(nèi)生真菌G-2液體發(fā)酵至7d時，加入不同混合濃度的6-BA 和NAA，研究其對生物合成鬼臼毒素的影響。結(jié)果見圖3所示。

圖3表明，在使用不同混合濃度的6-BA和NAA誘導(dǎo)G-2生物合成鬼臼毒素時，發(fā)酵液中鬼臼毒素的產(chǎn)量隨不同混合濃度比例發(fā)生變化，當6-BA和NAA的濃度比例為3：5時，鬼臼毒素的產(chǎn)量達到峰值，即932.39 %eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的產(chǎn)量增加明顯。

三、討論

植物內(nèi)生真菌是一類應(yīng)用前景廣闊的資源微生物，用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)鬼臼毒素，是解決藥源問題的有效途徑，且提高內(nèi)生真菌產(chǎn)鬼臼毒素的量是目前研究的熱點。

本研究通過在桃兒七內(nèi)生真菌液體發(fā)酵過程中添加植物生長調(diào)節(jié)劑，研究對G-2生物合成的鬼臼毒素影響。表明6-BA和NAA，6-BA和NAA不同混合濃度對G-2生物合成鬼臼毒素也有一定的促進作用，并且6-BA和NAA都可以促進G-2菌絲體的生長。

參考文獻：

[1]傅志軍，張萍.太白山國家保護植物優(yōu)先保護順序的定量分析[J].山地學(xué)報，2001， 19（2）：161-164.

[2]馬紹賓；胡志浩.桃兒七分布格局與生態(tài)適應(yīng)的初步研究[J].武漢植物學(xué)研究，1996 （01）： 135-137.

[3]何建清；陳芝蘭.桃兒七的經(jīng)濟價值及栽培技術(shù)[J].中國野生植物資源. 2003 （03）： 189-193.

[4]劉蕓，殷紅，彭輝，等.植物內(nèi)生真菌潛在的天然藥物新來源[J].中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2005，3（5）：404-405.