肥大細胞在抗腎小球基膜腎炎患者腎組織浸潤中的意義

肥大細胞來源于骨髓造血細胞，進入外周循環(huán)系統(tǒng)，在血管組織或漿膜腔中完成分化和(或)成熟，通過局部分泌炎癥介質或引發(fā)系統(tǒng)反應參與炎癥反應的多個步驟[1]。既往數(shù)十年內，肥大細胞被認為在過敏反應中發(fā)揮重要作用，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，在多種免疫應答中，尤其是在持續(xù)性炎癥及組織重建的狀態(tài)下(如肝硬化，肺纖維化及傷口愈合等)過程中[2]，肥大細胞的分布常伴隨纖維化形成，表明肥大細胞可能參與這些病理過程[3]。近年來研究也發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎炎、急性間質性腎炎和慢性間質性腎炎等多種腎臟疾病中，均存在肥大細胞增多現(xiàn)象[8-14]。我們前期研究以腎移植供腎為對照也發(fā)現(xiàn)，抗腎小球基膜(GBM)腎炎患者腎組織中肥大細胞數(shù)量明顯增多。鄭敬民等[9]曾報道肥大細胞加重腎臟炎癥及纖維化，并通過脫顆粒分泌類胰蛋白酶至腎臟間質進而參與糖尿病腎病過程。

單核巨噬細胞被認為在新月體及腎間質損害中發(fā)揮關鍵作用[6-8]，單核細胞在腎小球及腎間質的浸潤被認為是急進性新月體形成及腎間質改變的起始事件，而肥大細胞由于與單核巨噬細胞擁有類似表型特征[9]，故其可能也參與新月體腎炎的發(fā)生發(fā)展過程[10]?？笹BM腎炎，以急進性腎炎(RPGN)為特征，起病急驟，進展迅速，預后差；病理表現(xiàn)為腎小球大量新月體形成及包囊壁斷裂，間質炎癥反應和纖維化病變程度與腎小球病變的嚴重程度相平行，并直接影響患者的預后。已有部分動物實驗報道肥大細胞在抗GBM腎炎中的作用，但在人類抗GBM腎炎中卻鮮有報道。本文對抗GBM腎炎患者腎組織中肥大細胞的數(shù)量、分布、臨床及組織病理的關系進行了分析研究。

對象與方法

病例選擇選取2001年～2010年經腎活檢明確診斷為抗GBM腎炎的患者38例，所有患者均予以甲潑尼龍沖擊治療后續(xù)口服潑尼松/嗎替麥考酚酯或環(huán)磷酰胺沖擊治療。收集患者臨床及病理資料，根據(jù)患者腎活檢病理組織中肥大細胞數(shù)量將38例患者分為組1(肥大細胞計數(shù)<50 個/mm2，n=18)及組2(肥大細胞計數(shù)≥50 個/mm2，n=20)，比較兩組患者臨床資料、實驗室檢查及病理結果。

臨床資料及實驗室檢查臨床資料數(shù)據(jù)，包括一般狀況、性別、年齡、病程及臨床表現(xiàn)。實驗室檢查，包括尿蛋白定量，尿沉渣紅細胞計數(shù)(RBC)，腎小管功能指標[N-乙酸-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)，視黃醇結合蛋白(RBP)]，血紅蛋白，血清肌酐(SCr)和血清學試驗(如抗GBM抗體滴度、補體C3和C4)。

高血壓定義為成人靜息收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg；兒童收縮壓≥120 mmHg和(或)舒張期血壓≥80 mmHg，至少需兩次測量。鏡下血尿定義為尿沉渣紅細胞計數(shù)≥1.0萬/ml。蛋白尿定義為尿蛋白定量>0.4 g/24 h。腎病綜合征定義為尿蛋白定量≥3.5 g/24 h，血清白蛋白<30 g/L。腎功能不全定義為SCr>109.62 μmol/L。慢性腎功能衰竭(CRF)定義為SCr>109.62 μmol/L持續(xù)至少3月，腎皮質回聲增強。根據(jù)2012年KDOQI將急性腎損傷(AKI)定義為48h內SCr升高≥26.52 μmol/L，或者7d內SCr升高至≥1.5倍基礎值，或者尿量<0.5 mL/(kg·h)達6h。終末期腎病(ESRD)定義為SCr≥530 μmol/L 或腎臟替代治療超過3月。

組織學檢查光鏡，腎穿刺活檢標本經氯化汞-苦味酸，石蠟包埋，切片1.5 μm。分別HE、PAS、PASM-Masson和Masson三色染色。觀察腎小球，腎小管間質及血管病變。腎小管和間質慢性病變的程度根據(jù)受累的范圍進行半定量評分：1分(輕度，<25%)，2分(中度，25%～50%)，3分(重度，>50%)。常規(guī)石蠟切片免疫組化Envision法檢測間質和腎小球T淋巴細胞(CD4、CD8)，巨噬細胞(CD68)陽性和增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞。以NIS E1 ement BR3.4軟件測量所選區(qū)域間質面積，得到浸潤炎癥細胞平均數(shù)。免疫熒光采用直接法IgG、IgA、IgM、C3、及C1q染色。

腎臟肥大細胞的檢測胰蛋白酶(Novocastra公司，1∶2 000)免疫組化染色進行標記腎肥大細胞。CD68(DaKo公司，1∶100)用于標記巨噬細胞。使用單盲方法一個高倍視野下兩個不同的研究者觀察，對至少20個隨機選擇的區(qū)域進行了檢查，對胰蛋白酶免疫組化染色陽性的細胞(肥大細胞)的總數(shù)進行計數(shù)。以NIS E1 ement BR3.4軟件測量所選區(qū)域間質面積，得到肥大細胞平均數(shù)。

統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行分析。計量資料根據(jù)其是否正態(tài)分布分別以均數(shù)±標準差或中位數(shù)(25%分位數(shù)～75%分位數(shù))表示，分類數(shù)據(jù)采用率(百分比)表示。組間均值比較采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗，兩組之間率的比較采用χ2檢驗及確切概率法檢驗，變量間相關性探討采用Spearman相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結 果

一般情況和臨床特點所有患者均表現(xiàn)為RPGN，65.8%患者伴肉眼血尿，84.2%合并高血壓。組2患者病程較長，年齡較大，發(fā)生肉眼血尿患者較多，少尿/無尿比例較高且CRF較多但兩組之間無顯著差異(表1)。

表1 一般情況和臨床特征

實驗室檢查組2患者SCr較高，而尿滲透壓較低，血尿及低蛋白血癥程度較輕盡管兩組間無顯著性差異，但觀察到組2患者蛋白尿較輕，貧血程度較重、抗GBM抗體滴度較高(表2)。

表2 兩組患者實驗室檢查結果

組織學檢查組2患者腎小球硬化和包囊破裂比例較高且間質纖維化程度重(P>0.05)，纖維性/纖維細胞新月體比例較高(P<0.05)，細胞性新月體比例較低(P>0.05)。組2腎組織間質可見較多炎性細胞。尤其是CD8+細胞(180 個/mm2vs268 個/mm2，P<0.05)及CD68+細胞(534 個/mm2vs792 個/mm2，P<0.05)(表3)。免疫熒光均表現(xiàn)IgG沿腎小球毛細血管袢呈線狀沉積，常伴顆粒狀或非連續(xù)性C3沉積。當新月體擠壓毛細血管袢只是血管袢開放欠佳時，IgG線狀沉積可不典型。

表3 兩組患者的組織病理學特征

表4 肥大細胞與臨床病理特征之間的相關性

討 論

肥大細胞作為炎癥細胞的重要成員，既往研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥和纖維化部位有大量浸潤[1-3]。近年來對肥大細胞在新月體腎小球腎炎發(fā)病機制中作用的了解逐漸增多[11-13]。然而，在為數(shù)不多的動物實驗報道中關于肥大細胞在抗GBM腎炎中的作用所得結果并不一致，目前尚無關于肥大細胞在人類抗GBM腎炎的相關報道，其在抗GBM腎炎中的作用仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)在人類抗GBM腎炎腎組織間質中肥大細胞浸潤并研究其與臨床及病理特征的關系。組2患者臨床表現(xiàn)及腎臟病理表現(xiàn)較組1慢性化表現(xiàn)較明顯。相關性分析表明，腎臟肥大細胞與新月體和腎小管間質炎癥細胞，包括巨噬細胞和CD8陽性T淋巴細胞的數(shù)量顯著相關。以上結果表明肥大細胞可能加重腎臟慢性病變。據(jù)報道，SCr高，少尿或無尿，晚期診斷等已被證實為腎臟預后較差的預測因素，起病時SCr水平是導致ESRD的獨立預測因素[14-17]。通過觀察一般情況和臨床特征，盡管兩組間無顯著差異，較多肥大細胞浸潤組(組2)患者具有病程較長，年齡較大，較少AKI和較多CRF的傾向，表明肥大細胞可能與慢性腎損害相關。臨床數(shù)據(jù)較高水平的SCr及尿RBP，但滲透壓較低，少尿/無尿比例較高，貧血程度較重，尿蛋白和鏡下血尿較少等慢性腎功能損害表現(xiàn)，及較高滴度的抗GBM抗體，也支持肥大細胞浸潤可能與慢性腎功能病變相關。在這些患者中，我們觀察到更多的肥大細胞浸潤，間接證明肥大細胞浸潤與腎臟慢性病變相關。

本研究中所有患者腎臟病理表現(xiàn)較重，均有>40%的新月體，平均為88.4%±17.7%，超過三分之一的患者新月體比例>85%，纖維性/纖維細胞性新月體達57.3%，與本研究中患者晚期診斷相關。隨著抗GBM腎炎疾病進展，病理表現(xiàn)腎小球新月體可呈纖維細胞性隨后轉化為纖維性新月體，伴隨間質纖維化等腎小管間質損害的慢性化病變。兩組比較發(fā)現(xiàn)，組2纖維性/纖維細胞性新月體和球性硬化等晚期新月體比例較高，相關分析進一步證實，肥大細胞浸潤與晚期新月體的比例呈正相關，表明肥大細胞參與腎小球慢性化病變，大量晚期新月體難以由免疫抑制治療逆轉和并導致ESRD。既往Tóth等[10]的研究也同樣發(fā)現(xiàn)在合并細胞纖維性新月體的腎小球腎炎中，肥大細胞計數(shù)明顯增多。Timoshanko等[11]的研究也表明肥大細胞加重新月體腎炎進展。人們研究已認識新月體腎炎主要與Th1細胞和腎小球T細胞效應相關[18]。Hochegger等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)肥大細胞可介導T淋巴細胞、巨噬細胞浸潤。結合本研究及既往研究發(fā)現(xiàn)，肥大細可通過介導T淋巴細胞、巨噬細胞浸潤進而促進新月體形成，但仍需進一步研究證實肥大細胞在腎小球損傷的免疫調節(jié)的作用。

導致CRT進展的病理改變除腎小球硬化外，也包括腎小管間質纖維化[19]。本研究也顯示肥大細胞與腎小管間質損傷相關。在病理切片中發(fā)現(xiàn)肥大細胞浸潤主要分布于腎間質(圖1)，較多肥大細胞浸潤的患者其間質小管病變較嚴重，與臨床及實驗室檢查結果(較高的SCr和RBP)一致，表明肥大細胞可能與腎小管損傷相關，且可能是加重腎損害的另一因素。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，接受血液透析患者肥大細胞浸潤的程度往往更嚴重。肥大細胞與RBP、SCr和纖維化程度的水平正相關，也進一步證實肥大細胞參與腎小管間質損傷?；谶@些觀察，肥大細胞可通過促進腎小管間質損傷導致腎功能減退。在其他腎臟疾病中也同樣報道了相似的間質病變[4，20]。據(jù)報道，腎小管間質損害程度是腎功能進行性下降重要決定因素之一[21]。這些研究發(fā)現(xiàn)均表明，肥大細胞在腎小管間質損害中的作用不容忽視。實驗性研究已經發(fā)現(xiàn)肥大細胞促進腎小管間質損害的某些可能機制。部分研究結果強調間質纖維化、肥大細胞聚集與局部腎組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)作用密切相關[22-25],表明肥大細胞可能誘導RAS激活。并且肥大細胞能夠釋放各種成纖維因子和生長因子(包括組胺、類胰蛋白酶、轉化生長因子及堿性成纖維細胞生長因子等)，而這些因子具有成纖維細胞促有絲分裂活性及可增強膠原蛋白的合成[2，26]。

圖1 肥大細胞主要分布于抗腎小球基膜腎炎患者腎組織腎間質區(qū)域(↑)(IH，×200)

如前所述，肥大細胞可介導和增強T細胞和巨噬細胞浸潤。本研究中發(fā)現(xiàn)組2炎性細胞浸潤較組1增多，尤其是CD8細胞及CD68細胞。巨噬細胞已被證明在新月體形成中發(fā)揮重要的作用。巨噬細胞聚集可預測腎功能損害程度和疾病的進展[27]?；诒疚南嚓P性分析中肥大細胞和巨噬細胞的正相關推測，肥大細胞與巨噬細胞的相互作用可能在加重病情發(fā)展中起部分作用。T淋巴細胞可誘發(fā)間質炎癥，加重腎損傷，且T細胞在新月體的形成及發(fā)展中同樣扮演不可忽視的角色。前文已述，肥大細胞具有介導T細胞聚集的作用。肥大細胞與T細胞及巨噬細胞的相互作用可解釋肥大細胞加重腎臟損害的作用。這些假說也得到了其他研究的支持，揭示肥大細胞和其他免疫細胞的相互作用可促進疾病惡化。肥大細胞可產生和釋放一些介質，這些介質可以調節(jié)生物反應，調節(jié)細胞因子的表達或炎性細胞浸潤[28]。Tanda等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)浸潤的肥大細胞具有通過招募遲發(fā)型超敏反應(DTH)白細胞浸潤誘導腎功能損傷的作用。這些局部效應與肥大細胞在皮膚的DTH作用相似。肥大細胞和炎癥細胞之間的相關性表明，肥大細胞可促進抗GBM腎炎腎臟炎癥反應。

相關分析表明肥大細胞浸潤與球性硬化、腎間質纖維化程度及間質細胞浸潤(尤其是CD8及CD68陽性細胞)呈正相關。肥大細胞導致的腎功能減退可能與腎小球和腎小管的病理變化均有關，意味著肥大細胞可能與疾病晚期階段相關，進一步證實我們的觀點——肥大細胞與腎臟慢性病變相關。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞促進抗GBM腎炎的進展，但由于臨床研究的限制，尚未明確其機制。而肥大細胞缺陷的大鼠和小鼠實驗性研究表明肥大細胞在抗GBM腎炎扮演活躍角色，但各項研究并未得出一致結果，肥大細胞在腎臟損傷的作用目前仍有爭論，因此仍需要進一步研究以明確其確切機制。

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