高效液相色譜法與熒光偏振免疫法測(cè)定人全血環(huán)孢素A濃度的比較

環(huán)孢素A(CsA)是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，臨床主要用于預(yù)防同種異體腎、肝、心臟等器官或組織移植所發(fā)生的排斥反應(yīng)，也用于預(yù)防及治療骨髓移植時(shí)發(fā)生的移植物抗宿主反應(yīng)，由于臨床應(yīng)用CsA使移植器官存活率提高了80％～90％。但CsA治療指數(shù)窄，個(gè)體差異較大，血藥濃度過(guò)高可引起肝腎毒性，過(guò)低則易發(fā)生排斥反應(yīng)。因此，監(jiān)測(cè)CsA在全血的濃度，調(diào)整其濃度在安全有效范圍具有重要的臨床意義[1]。

目前，測(cè)定環(huán)孢素血藥濃度的方法主要有高效液相色譜(HPLC)法、熒光偏振免疫(TDx)法、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)法、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法、放射免疫(RIA)法和受體結(jié)合(RBA)法[2-4]。由于血藥濃度監(jiān)測(cè)方法不統(tǒng)一，監(jiān)測(cè)結(jié)果存在很大差異，根據(jù)不同方法所確定的治療藥物濃度范圍也不同，這給臨床應(yīng)用和評(píng)價(jià)帶來(lái)不便。國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道關(guān)于各種測(cè)定方法間比較[4-7]，國(guó)內(nèi)醫(yī)院多采用單克隆TDx法，此法對(duì)環(huán)孢素的體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，實(shí)際測(cè)得結(jié)果為CsA及代謝物之和。HPLC法測(cè)定結(jié)果為CsA原型藥物濃度，因此能更準(zhǔn)確地說(shuō)明藥物濃度、療效、不良反應(yīng)三者間的關(guān)系[8]。為更好地指導(dǎo)臨床合理用藥， 本研究擬以TDx監(jiān)測(cè)方法為參照，對(duì)CsA全血樣本進(jìn)行HPLC分析，考察兩種方法的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

樣品來(lái)源標(biāo)本全部來(lái)自南京軍區(qū)福州總醫(yī)院泌尿外科、血液科、腎內(nèi)科住院患者和門診隨訪患者常規(guī)監(jiān)測(cè)全血樣本。本試驗(yàn)分別用HPLC法和TDx法對(duì)92例患者的全血標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)。

儀器Agilent1200 HPLC儀(美國(guó)Agilent公司)；AL204精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； LD5-2A型臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)院離心廠)；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī) (上海安寧科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)； BF2000氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；熒光偏振免疫分析儀(TDxFLx，美國(guó)Abbott公司)。

試劑CsA試劑盒(批號(hào):69398Q101,美國(guó)Abbott公司)；CsA質(zhì)控盒(120085JN00 2012-04-07)。CsA對(duì)照品(福建科瑞醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：130495．200202，純度99．7％)；環(huán)孢素D(CsD)對(duì)照品(福建科瑞醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：0104006 416，純度99.0％)；乙腈、甲醇(色譜純；上?？曝S化學(xué)試劑有限公司)；正己烷(分析純；上?？曝S化學(xué)試劑有限公司)；乙醚(分析純；上海聯(lián)試化工試劑有限公司；使用前重蒸餾)。

HPLC法測(cè)定血藥濃度

色譜條件 色譜柱為Inertsil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水(38∶62，v/v)；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μl；柱溫55℃。

對(duì)照品溶液的制備 CsA溶液的配制：稱取CsA對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000 mg/L的CsA儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前取出平衡至室溫后，取適量?jī)?chǔ)備液用甲醇稀釋成濃度分別為40 ng/ml、80 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1200 ng/ml和2500 ng/ml的CsA對(duì)照品溶液。

CsD內(nèi)標(biāo)液的配制：稱取CsD對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000 mg/L的CsD儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液1 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為40 mg/L的CsD內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

血樣處理方法 取1.0 ml全血樣品置15ml玻璃離心管中，加入10 μl內(nèi)標(biāo)液(相當(dāng)于400 ng CsD)、500 μl 0.2 mol/L NaOH溶液，渦旋30s，加入5 ml重蒸乙醚，渦旋提取3 min，4000 r/min離心10 min，取乙醚層4 ml于5 ml的離心試管中，40℃氮?dú)獯蹈?，加入水∶乙?1∶1)100 μl復(fù)溶，渦旋30s，加入200 μl正己烷(用乙腈飽和)，渦旋30s，4000 r/min離心15 min，取下層溶液進(jìn)樣分析。

方法專屬性 取空白全血1 ml，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“血樣處理方法”項(xiàng)下全血樣品處理方法操作，進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖；將一定濃度CsA和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白全血，依同法操作，記錄色譜圖；取受試者服藥后收集的血液樣品，依同法操作，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明，空白全血中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾CsA和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

圖1 CsA高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取空白全血1ml，加入“對(duì)照品溶液的制備”項(xiàng)下CsA對(duì)照品各溶液10 μl，配制成相當(dāng)于CsA濃度為40 ng/ml、80 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1200 ng/ml和2500 ng/ml的模擬人全血樣品，按“血樣處理方法”項(xiàng)下全血樣品處理方法操作，進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)(X)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程為：Y=2.209×10-3X+3.841×10-2，r=0.9997。結(jié)果表明，CsA在40～2500 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限為40 ng/ml。

精密度和準(zhǔn)確度 取空白全血1 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下方法配制CsA低、中、高三個(gè)濃度(分別為80 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)全血樣品，按“血樣處理方法”項(xiàng)下全血樣品處理，每一濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，連續(xù)測(cè)定3d，記錄測(cè)得濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和回收率(表1)。

表1 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

樣品穩(wěn)定性 取空白全血1 ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和定量下限”項(xiàng)下方法配制CsA低、中、高三個(gè)濃度(分別為80 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)質(zhì)量控制(QC)生物樣品，于室溫放置8 h、-20 ℃冷凍放置30d和經(jīng)三次冷凍-解凍循環(huán)處理后，考察樣品穩(wěn)定性。每批次5樣本分析。結(jié)果表明CsA人全血樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好(表2)。

表2 人全血樣品中環(huán)孢素A穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=5)

TDx法測(cè)定血藥濃度精密吸取被檢標(biāo)本全血150 μl，放入離心管中，加入50 μl細(xì)胞溶解劑，再加入CsA蛋白沉淀劑300 μl，充分振蕩后，離心，取上清液置TDxFLX儀器內(nèi)，將CsA試劑盒放入儀器內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件。分別用TDx法和HPLC法測(cè)得92例全血中CsA濃度，將TDx法測(cè)定的結(jié)果作為橫坐標(biāo)(X) ，HPLC法測(cè)定的結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，評(píng)價(jià)兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性。用配對(duì)t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)2種方法測(cè)定結(jié)果有無(wú)差異。通過(guò)計(jì)算 “(TDx法測(cè)定濃度-HPLC法測(cè)定濃度)/ HPLC法測(cè)定濃度×100％”的值來(lái)描述兩種方法之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

TDx法和HPLC法測(cè)定患者血中CsA濃度的相關(guān)性研究采集本院腎移植受者常規(guī)監(jiān)測(cè)全血樣本92例，分別用HPLC和TDx 兩種方法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定(92例血樣在不同的工作日采集并平行測(cè)定)。TDx法(X)與HPLC法(Y)測(cè)定的CsA血藥濃度結(jié)果見圖2。

圖2 HPLC法和TDx法測(cè)定CsA血藥濃度的相關(guān)性

對(duì)兩種方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，X與Y 的回歸方程為Y=0.826X+8.318 ，r=0.9665，遠(yuǎn)大于不相關(guān)臨界值，即兩種方法有較好的相關(guān)性。用配對(duì)t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種方法測(cè)定結(jié)果是否存在差異，結(jié)果顯示，在95％置信區(qū)間內(nèi)兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異(P<0.01)。通過(guò)計(jì)算 “(TDx法測(cè)定濃度-HPLC法測(cè)定濃度)/HPLC法測(cè)定濃度×100％”的均值可知，TDx法測(cè)定結(jié)果比HPLC法測(cè)定結(jié)果平均高出25.44％。

TDX法和HPLC法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)全血樣品中CsA濃度的相關(guān)性研究取空白全血，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下方法配制CsA低、中、高三個(gè)濃度(分別為80.0 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)全血樣品，分別用TDx和HPLC兩種方法進(jìn)行測(cè)定，每一濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種方法測(cè)定結(jié)果是否存在差異(表3)。

表3 兩種方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)全血中環(huán)孢素A的結(jié)果(n=5)

以上結(jié)果顯示，HPLC法測(cè)定結(jié)果與實(shí)際值較接近(RE<3％)，TDx法測(cè)定結(jié)果比HPLC法測(cè)定結(jié)果高出約10％，但低濃度時(shí)兩組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，中、高濃度時(shí)兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

討 論

CsA在血漿中與血漿蛋白和紅細(xì)胞的結(jié)合率很高，且在紅細(xì)胞和血漿中的分布受溫度、細(xì)胞壓積、藥物濃度等多種因素影響。因此，必須采用全血樣品進(jìn)行測(cè)定，以保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。本試驗(yàn)建立了液液萃取處理血樣和HPLC測(cè)定全血中CsA濃度的方法，采用重蒸乙醚作為萃取劑，減少了雜質(zhì)的干擾。用NaOH溶液作為堿化劑，不僅可使與紅細(xì)胞結(jié)合的CsA因溶血而易于提取入醚層，同時(shí)可使一些溶于堿液的雜質(zhì)留在水相，但NaOH體積不可過(guò)大，否則水相比例過(guò)高，CsA提取回收率會(huì)降低。根據(jù)CsA微溶于正己烷的性質(zhì)，采用正己烷洗滌來(lái)去除脂溶性雜質(zhì)的干擾。正己烷在使用前應(yīng)用乙腈預(yù)飽和，有利于分層，減少CsA的損失。此方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好，且成本較低。

本研究發(fā)現(xiàn)，TDx法測(cè)的患者CsA全血藥物濃度明顯高于HPLC法測(cè)定結(jié)果(25.44％)(P<0.01)。將兩種分析方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種方法測(cè)定CsA全血藥物濃度相關(guān)性較好，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[4,5]。用TDx和HPLC兩種方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)全血樣品中CsA的濃度結(jié)果顯示，HPLC法測(cè)定結(jié)果與實(shí)際值較接近(RE<3％)，TDx法測(cè)定結(jié)果偏離實(shí)際值較大(RE>7.5％)。低、中、高三個(gè)濃度測(cè)定結(jié)果均高于HPLC測(cè)定結(jié)果，低濃度時(shí)兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，中、高濃度時(shí)兩種方法測(cè)定結(jié)果差異顯著，而測(cè)定患者血樣時(shí)，TDx法測(cè)定結(jié)果比HPLC法測(cè)定結(jié)果高出25.44％。由此可知，TDx法測(cè)定結(jié)果，不只受CsA體內(nèi)代謝產(chǎn)物及與藥物交叉反應(yīng)的影響，還可能存在其他的影響因素。 HPLC法提取、反復(fù)萃取的步驟較多，加上對(duì)紅細(xì)胞的破壞，也可能是TDx法測(cè)定結(jié)果高于HPLC法的原因。

用HPLC法測(cè)定CsA血藥濃度相對(duì)復(fù)雜費(fèi)時(shí)，但成本較TDx法低?；颊邩悠妨可贂r(shí)，HPLC法可以作為測(cè)定CsA 的血藥濃度的一個(gè)科學(xué)、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的測(cè)定方法，只是參考值比TDx偏低。樣品量大時(shí)用TDx法測(cè)定CsA血藥濃度較方便、省時(shí)。

小結(jié)：CsA各種檢測(cè)方法所得結(jié)果存在很大差別，臨床醫(yī)師在分析CsA濃度結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意其檢測(cè)方法，各實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告檢查結(jié)果時(shí)也應(yīng)注明所用檢測(cè)方法，以便臨床醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，準(zhǔn)確調(diào)整患者用藥劑量，使腎移植受者應(yīng)用CsA劑量更為合理，以降低毒性反應(yīng)和排斥反應(yīng)。

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