內皮素-1誘導大鼠腎小管上皮細胞轉分化的可能機制

腎小管上皮細胞轉分化(TEMT)可促進細胞外基質(ECM)增多、沉積及腎臟結構重構，是腎間質纖維化(RIF)的重要機制之一。目前已發(fā)現(xiàn)高糖、轉化生長因子β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等均可促進TEMT。內皮素-1(ET-1)作為重要的致炎及促纖維化分子，與其受體結合后通過各種途經(jīng)促進ECM增多、細胞增生、炎性細胞浸潤，從而介導RIF。隨著對RIF發(fā)生機制的深入研究，ET-1在TEMT中的作用越來越受到重視。目前已有學者在糖尿病腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)ET-1與TEMT關系密切[1]，也有學者在體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)ET-1可能參與了高糖誘導的TEMT[2]，但是ET-1對腎小管上皮細胞的直接作用目前研究較少。本研究應用ET-1刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞并進行干預實驗，觀察相關指標的變化，旨在探討ET-1是否能誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生轉分化及可能的分子機制。

材料與方法

主要材料腎小管上皮細胞(NRK52E，中山大學附屬第一醫(yī)院腎內科余學清教授惠贈)，DMEM培養(yǎng)基(北京鼎國昌盛生物技術公司)，ET-1、BQ123、SB203580(美國Sigma公司)，小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、兔抗大鼠α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)多克隆抗體(美國abcam公司)，兔抗大鼠E鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(上海生工)，兔抗大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化-p38MAPK(p-p38MAPK)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，Western印跡設備(美國Bio-Rad公司)，反轉錄試劑盒(Fermentas公司)，RT-PCR擴增儀(德國Biometra公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

細胞培養(yǎng)及分組NRK52E于含10％牛胎血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中37℃，5％CO2貼壁培養(yǎng)，以0.25％胰酶消化，1∶4傳代，待生長至70％～80％融合時用無血清的培養(yǎng)基同步化12h后進行分組：陰性對照組；ET-1濃度梯度組：ET-1(10-11、10-9、10-7mol/L)刺激細胞60h；ET-1時間梯度組：ET-1(10-7mol/L)刺激細胞12h、24h、36h、48h、60h；BQ123預處理組：BQ123(2 μg/ml)預處理0.5h后ET-1(10-7mol/L)刺激細胞60h；SB203580預處理組：SB203580(10-5mol/L)預處理0.5h 后ET-1(10-7mol/L)刺激細胞60h。倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化。

Western印跡法檢測E-cadherin、α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表達收集各組細胞，按照全細胞裂解液說明書提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每份樣本取20 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，在含5％脫脂牛奶的1×TBST中室溫封閉1h。孵育一抗，加入E-cadherin抗體(1∶200)，α-SMA抗體(1∶500)，p38MAPK和p-p38MAPK抗體(1∶500)及GAPDH抗體(1∶1000)4℃過夜。次日TBST漂洗3次，10min，再用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔及馬抗小鼠二抗(1∶500)室溫孵育1.5h，TBST漂洗3次，10 min。DAB顯色、成像。按相同實驗條件重復實驗3次。ImageJ軟件分析目的條帶灰度值。

RT-PCR法檢測E-cadherin及α-SMA mRNA的表達按照TRIzol說明書在培養(yǎng)瓶中提取各組細胞的總RNA，經(jīng)紫外線分光光度計測定RNA濃度，取總RNA 2 μg作逆轉錄，實驗步驟參照逆轉錄試劑盒說明書。取2 μl逆轉錄產(chǎn)物為模板，以20 μl反應體系進行PCR擴增。引物序列：E-cadherin上游引物5’- CTACCCACGGCAAGTTCAAT- 3’，下游引物5’-GGA TGCAGGGATGAT-3’；α-SMA上游引物5’-CCCTAAAACCCTAAAGCCAACA-3’，下游引物5’-GCAGTGCATAGCCCTCGT-3’；GAPDH上游引物5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3’，下游引物5’-GGATGCAGGGATGAT-3’，擴增條件：E-cadherin預變性94℃ 3 min，變性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 1 min，36個循環(huán)后72℃ 5 min；α-SMA退火55℃，GAPDH退火54℃，其余條件同前。將PCR產(chǎn)物加入1.25％瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描，用GAPDH作為內參計算mRNA的相對表達量，并進行3次獨立實驗。

統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標準差表示，成組設計資料多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

ET-1、SB203580和BQ123對細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察陰性對照組細胞在培養(yǎng)過程中始終呈典型的鵝卵石樣，融合狀態(tài)時細胞間連接緊密，以ET-1(10-7mol/L)刺激細胞60h后，細胞呈梭形改變，放射狀排列，細胞間隙明顯增大，分別應用SB203580和BQ123預處理細胞后，細胞的梭形改變明顯減輕。

不同濃度ET-1對細胞E-cadherin及α-SMA表達的影響應用濃度為10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L 的ET-1刺激細胞60h，各濃度組E-cadherin蛋白和mRNA的表達均低于陰性對照組(P<0.05)，并隨著濃度的升高，表達逐漸減少，α-SMA蛋白和mRNA的表達均高于陰性對照組(P<0.05)，并隨著濃度升高，表達增多(圖1)。

ET-1作用不同時間對細胞E-cadherin及α-SMA表達的影響ET-1(10-7mol/L)刺激細胞12h、24h、36h、48h、60h，E-cadherin蛋白和mRNA的表達在36h顯著減少(P<0.05)，于60h達最低值(P<0.05)，α-SMA蛋白和mRNA的表達在36h顯著增加(P<0.05)，于60h達高峰(P<0.05)(圖2)。

圖1 不同濃度ET-1對E-cadherin及α-SMA表達的影響

圖2 ET-1作用不同時間對E-cadherin及α-SMA表達的影響

ET-1、SB203580和BQ123對細胞E-cadherin、α-SMA、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達及p38MAPK磷酸化水平的影響以p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達量代表p38MAPK磷酸化水平，即p38MAPK活性。與陰性對照組相比，ET-1組E-cadherin表達減少，α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK表達增加，p38MAPK活性增強(P<0.05)；與ET-1組相比，SB203580預處理組E-cadherin表達相對增加，α-SMA及p-p38MAPK表達相對減少，p38MAPK活性減弱(P<0.05)，p38MAPK的表達無顯著性差異；與ET-1組相比，BQ123預處理組E-cadherin表達相對增加，α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK表達相對減少，p38MAPK活性減弱(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組細胞中E-cadherin、α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表達和p38MAPK磷酸化水平

討 論

近年來，TEMT與RIF的關系是國內外學者研究的熱點，盡管TEMT 在RIF中的作用存在爭議[3]，但是越來越多的體外細胞實驗及動物模型證實了作為肌成纖維細胞(MyoF)的重要來源的TEMT具有促進RIF發(fā)生、發(fā)展的作用。

ET-1是已知作用最強和效應最持久的內源性血管收縮劑，除了改變血流動力學作用外，還是參與各種慢性腎臟疾病RIF重要的效應分子[4-6]。腎臟的固有細胞均可產(chǎn)生ET-1，其中腎小管上皮細胞還可通過自分泌和旁分泌ET-1導致RIF。國外學者在研究卵巢癌的發(fā)生、肺間質纖維化過程中均發(fā)現(xiàn)ET-1具有促進上皮細胞轉分化的作用[7,8]，而ET-1是否具有誘導TEMT的作用目前尚未研究。E-cadherin是腎小管上皮細胞間緊密連接的重要成分，在保持細胞完整性中起重要作用，是上皮細胞特異蛋白之一。細胞間緊密連接破壞是上皮細胞轉分化發(fā)生的關鍵步驟之一，抑制E-cadherin，可促進上皮細胞轉分化[9]。α-SMA是具有收縮功能的細胞骨架微絲結構，是MyoF的標志蛋白。α-SMA在正常的腎小管上皮細胞幾乎不表達，在轉分化過程中表達增加，是上皮細胞發(fā)生轉分化的標志。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，ET-1刺激細胞使其發(fā)生了形態(tài)學改變，由鵝卵石樣變成梭形，而內皮素A受體拮抗劑BQ123預處理細胞后，細胞的梭形改變明顯減弱。此外陰性對照組表達E-cadherin，而幾乎不表達α-SMA，應用ET-1刺激腎小管上皮細胞后，E-cadherin表達減少，α-SMA表達增多，且呈濃度及時間依賴性，表明腎小管上皮細胞在ET-1的作用下發(fā)生了由上皮細胞表型向MyoF表型轉變，而BQ123能顯著抑制ET-1引起的上述效應，提示ET-1可誘導TEMT，因此ET-1的促RIF作用機制之一可能是通過ET-1誘導TEMT實現(xiàn)的。

p38MAPK作為MAPK家族中的一員，是細胞外信號刺激引細胞核反應的共同通路，它通過影響基因的轉錄和調控，進而影響細胞的生物學行為，如細胞的存活、分化及凋亡[10]。Stambe等[11]發(fā)現(xiàn)p38MAPK可能作為TGF-β1的下游信號分子在RIF中發(fā)揮重要作用。而在單側輸尿管梗阻大鼠RIF動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)p38MAPK可能參與了腎小管間質纖維化過程[12]。Lv等[13]應用siRNA沉默p38MAPK，能顯著減弱高糖誘導TEMT。這些研究提示p38MAPK信號通路與RIF及上皮細胞轉分化密切相關。ET-1與其受體結合后能激活多種信號途徑，如磷脂酶C、絲氨酸/蘇氨酸激酶、p38MAPK級聯(lián)反應等從而發(fā)揮相應的生物學效，如有研究發(fā)現(xiàn)ET-1能激活腎小球系膜細胞p38MAPK，進而使ECM合成增多[14,15]。p38MAPK作為ET-1下游的信號分子，能否介導ET-1誘導的TEMT，為了進一步明確ET-1誘導轉分化過程中所涉及的信號通路，我們應用BQ123和p38MAPK特異性抑制劑SB203580干預ET-1刺激的腎小管上皮細胞，結果發(fā)現(xiàn)，ET-1能夠上調p-p38MAPK蛋白的表達，增強p38MAPK活性，而用BQ123預處理后，p-p38MAPK蛋白的表達減少，p38MAPK活性減弱，表明ET-1能激活p38MAPK信號通路。此外應用SB203580能明顯抑制ET-1誘導的α-SMA表達減少，E-cadherin表達增多，說明 p38MAPK信號通路可能參與ET-1誘導的TEMT過程。陳興無等[16]觀察人氣管上皮下成纖維細胞轉分化過程也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路可介導ET-1誘導上皮細胞轉分化。

本實驗進一步完善了ET-1致病的作用機制，ET-1可能通過激活腎小管上皮細胞p38MAPK通路，下調E-cadherin的表達，同時上調α-SMA的表達，從而誘導TEMT。因此一定程度抑制ET-1誘導的TEMT作用，可能是防治RIF的新途徑。

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