TCF7L2基因多態(tài)性與腎移植后糖尿病的相關(guān)性

2006年，Grant等[1]使用定位克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了2型糖尿病(T2DM)的第2個易感基因——轉(zhuǎn)錄因子7樣2基因(TCF7L2)，該基因位于10 號染色體，是迄今在歐洲、印第安、美國及亞洲人群等世界范圍內(nèi)重復(fù)性最好的糖尿病易感基因[1-3]。由于TCF7L2多態(tài)性顯示出強(qiáng)烈的易感效應(yīng)，得到了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。Kang等[4]研究結(jié)果提示TCF7L2 rs7903146與韓國腎移植后糖尿病(PTDM)的發(fā)病顯著相關(guān)。比利時的Ghisdal等[5]研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2 rs7903146的T等位基因與PTDM顯著相關(guān)。但Chang等[6]對中國臺灣漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs7903146在中國人群中較少見，且rs7903146與中國人群T2DM無相關(guān)性，反而是位于內(nèi)含子7的rs290487 與T2DM顯著相關(guān)，這可能與不同人群在遺傳背景上的差異所致[7]。Ren等[8]對我國漢族人群的研究則提示rs290487 與T2DM無顯著相關(guān)性(P=0.071)。TCF7L2基因多態(tài)性與中國人群PTDM的相關(guān)性目前尚未見報道，基于以上對中國人群TCF7L2基因各位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM相關(guān)性的研究結(jié)果，本研究選取了rs290487位點(diǎn)，采用實(shí)時熒光定量PCR方法，檢測了398例中國腎移植患者rs290487的基因型和突變頻率，分析該基因多態(tài)性與PTDM的相關(guān)性，探討TCF7L2基因是否為PTDM的易感基因。

對象和方法

研究對象1998年～2008年在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院進(jìn)行同種異體腎移植術(shù)的受者496例，排除術(shù)前合并糖尿病10例，術(shù)后失訪68例，再次腎移植13例，術(shù)后第1周死亡4例和術(shù)后第1月移植腎失功3例，共398例受者入組。均采用以環(huán)孢素或他克莫司為基礎(chǔ)的三聯(lián)免疫抑制治療方案。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會的診斷標(biāo)準(zhǔn)，腎移植術(shù)后受者的空腹血糖(FPG) ≥7 mmol/L或使用了降糖藥(胰島素或口服降糖藥)即診斷為PTDM，納入PTDM組，其他患者納入移植后非糖尿病組(對照組)，所有研究對象均詳細(xì)記錄性別、身高、移植時年齡和體重、原發(fā)腎臟病、移植時間、糖尿病家族史、透析時間、吸煙史、乙型肝炎和丙型肝炎感染史、高血壓病史、尸腎或親屬移植、詳細(xì)的免疫抑制治療方案(如劑量和濃度)、肝腎功能、FPG、血脂、血壓。

儀器與試劑7900HT 快速實(shí)時定量PCR儀(ABI)；離心機(jī)(Heraeus高速離心機(jī))，WH-1 微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。Wizard DNA提取試劑盒(Promega)、TaqMan? Universal PCR Master Mix(ABI)、TaqMan? SNP Genotyping Assays(rs290487，ABI)。其余試劑為分析純，蒸餾水經(jīng)重蒸餾處理。

DNA提取與測定采用全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

TCF7L2 rs290487基因型檢測采用TaqMan探針法實(shí)時定量PCR檢測。SNP Genotyping Assays由ABI公司提供，使用FAM和VIC作為探針的熒光標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix(AmpliTaq Gold DNA 聚合酶，AmpErase UNG酶，帶dUTP的dNTP，內(nèi)參1，優(yōu)化的緩沖液)2.5 μl，40×SNP Genotyping Assays 0.125 μl，DNA模板1.0 μl，無酶水(Nuclease-Free water)補(bǔ)足至5 μl。PCR反應(yīng)條件：變性95℃，10 min；循環(huán)92℃ 15s，60℃ 1 min，40次。

統(tǒng)計學(xué)處理采用Hardy-Weinberg平衡檢測基因型的分布是否具有代表性，PTDM組和對照組兩組間等位基因和各基因型頻率的差異采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析PTDM發(fā)病的危險因素，各變量與PTDM的關(guān)系采用單變量Logistic回歸分析，單變量分析有意義的變量再采用Backward Stepwise (Likelihood Ratio)方法進(jìn)行多變量Logistic回歸分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

PTDM組和對照組患者的一般情況比較398例入組的腎移植受者中，97例診斷為PTDM。PTDM組和對照組受者的一般情況見表1。PTDM組患者的透析時間、移植時的年齡、體重、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、男性患者比例均高于對照組(P<0.05或P<0.01)，兩組使用他克莫司的患者比例和移植前的FPG水平無差異。

表1 PTDM組與對照組受者腎移植前一般資料

兩組患者rs290487等位基因和基因型頻率分布PTDM組和對照組的CC基因型分別為27.8％和18.3％，TT基因型分別為26.8％和39.2％，兩組的基因型分布存在顯著差異(P=0.039)，PTDM組CC基因型頻率明顯高于對照組，而TT基因型頻率明顯低于對照組(表2)。

表2 兩組患者rs290487基因型分布比較

rs290487的基因分布符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。PTDM組和對照組患者的C等位基因頻率分別為50.5％和39.5％，T等位基因頻率分別為49.5％和60.5％，PTDM組的C等位基因頻率明顯高于對照組，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)(表3)。

表3 兩組患者rs290487等位基因頻率比較

TCF7L2基因rs290487與PTDM相關(guān)性在單因素Logistic回歸中，將TCF7L2基因rs290487納入變量分析結(jié)果顯示，CC基因型攜帶者移植術(shù)后發(fā)生PTDM的風(fēng)險是TT基因型攜帶者的2.353倍(95％CI：1.262～4.390，P=0.007)；用性別和移植時年齡等危險因素進(jìn)行校正后[9]，CC基因型攜帶者移植術(shù)后發(fā)生PTDM的風(fēng)險是TT基因型攜帶者的2.411倍(95％CI：1.263～4.605，P=0.008)(表4)。本課題的前期研究結(jié)果表明[9]，男性(OR=2.104，P=0.009)、年齡 (OR=1.041，P<0.001)、體重(OR=1.040，P=0.001)和BMI (OR=1.142，P<0.001)均是PTDM發(fā)病的危險因素，因此，在多因素Logistic回歸中，用性別、移植時年齡、體重和BMI等進(jìn)行校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CC基因型仍是腎移植后發(fā)生PTDM的危險因素(表4)。

合并CC基因型和CT基因型，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果表明，CC和CT基因型攜帶者腎移植術(shù)后發(fā)生PTDM的風(fēng)險是TT基因型攜帶者的1.761倍(95％CI：1.062～2.919，P=0.028)；用性別和移植時年齡進(jìn)行校正后，其OR=1.915(95％CI：1.136～3.228，P=0.015)；用性別、移植時年齡、體重和BMI進(jìn)行校正后，其OR=1.935(95％CI：1.141～3.281，P=0.014)。該結(jié)果表明TCF7L2基因rs290487的C等位基因是腎移植后發(fā)生PTDM的獨(dú)立危險因素。

表4TCF7L2rs290487與PTDM相關(guān)性的Logistic回歸分析結(jié)果

TCFTL2：轉(zhuǎn)錄因子7樣2基因；PTDM：腎移植后糖尿病；a：用性別和年齡進(jìn)行校正；b：用性別，年齡，體重和BMI進(jìn)行校正

討 論

研究表明，TCF7L2由胰腺β細(xì)胞表達(dá)，與胰島素分泌有關(guān)[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)非洲裔美國人和西非人TCF7L2基因多態(tài)性與T2DM相關(guān)[7,11]，但對北非人的研究結(jié)果卻與此不一致[12]。Peng等[13]的Meta-analysis納入了全球155項(xiàng)相關(guān)研究的121 174個病例-對照結(jié)果表明，rs7903146、rs12255372、rs11196205、rs7901695、rs7895340和rs4506565均與T2DM顯著相關(guān)(P<0.05)，但未發(fā)現(xiàn)rs290487、rs11196218與T2DM的相關(guān)性。

Kang等[4]研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2 rs7903146與韓國腎移植患者PTDM的發(fā)病顯著相關(guān)，CT基因型是其高危因素(OR=2.655，P=0.020)。Ghisdal等[5]的研究結(jié)果證實(shí)了TCF7L2 rs7903146位點(diǎn)的多態(tài)性與比利時腎移植患者術(shù)后發(fā)生PTDM顯著相關(guān)。但Chang等[6]對臺灣人群的研究顯示，rs7903146在中國人群中較少見，且與中國人群T2DM無相關(guān)性， 而rs290487位點(diǎn)與T2DM明顯相關(guān)，其CT和CC基因型的OR值分別為1.3和1.51(P<0.01)。目前國內(nèi)對該位點(diǎn)的相關(guān)研究結(jié)果尚存在爭議[14]。據(jù)報道，TCF7L2基因rs290487與遼寧[15]、濟(jì)南[16]漢族人群及北京漢族人群[8]T2DM無相關(guān)性，與安徽地區(qū)漢族人群[17]和哈爾濱人群[18]T2DM則顯著相關(guān)(P<0.05)。

根據(jù)以上研究結(jié)果，本研究檢測了399例腎移植受者的TCF7L2 rs290487多態(tài)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)， C等位基因頻率為39.5％～50.5％，明顯高于遼寧[15]、濟(jì)南[16]及安徽地區(qū)人群[17]，而且，PTDM組的C等位基因頻率明顯高于對照組(50.5％vs39.5％，P=0.008)，該結(jié)果與臺灣人群[6]中糖尿病組和正常對照組的基因頻率(42％vs36％)分布趨勢基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，PTDM組CC基因型頻率明顯高于對照組，也明顯高于國內(nèi)普通人群和T2DM人群[15-18]。Logistic回歸分析結(jié)果表明，rs290487的C等位基因是腎移植術(shù)后發(fā)生PTDM的獨(dú)立危險因素，與對臺灣人群[6]和安徽地區(qū)漢族人群[17]普通糖尿病的研究結(jié)果一致。

TCF7L2屬于核受體家族，間接介導(dǎo)Wnt信號傳導(dǎo)通路[19]。在胚胎發(fā)育過程中,胰腺和胰島的正常發(fā)育有賴于準(zhǔn)確的Wnt信號傳導(dǎo)。TCF7L2 rs290487位點(diǎn)突變，影響了Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)，可抑制腸內(nèi)分泌L細(xì)胞胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的表達(dá)，使機(jī)體血糖升高，從而導(dǎo)致糖尿病[20]。另一方面，TCF7L2與胰島B細(xì)胞功能缺陷、快速急性相胰島素分泌不足相關(guān)，該位點(diǎn)突變還可影響TCF7L2 及其他胰島素相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制機(jī)體胰島素的釋放[21-23]。因此TCF7L2的變異可能通過直接和間接途徑導(dǎo)致胰島細(xì)胞分泌胰島素不足及胰島B細(xì)胞數(shù)量的下降。TCF7L2變異個體的表型為糖刺激后胰島素分泌不足,但內(nèi)含子的變異引起TCF7L2在胰島B細(xì)胞表達(dá)異常及異常表達(dá)的TCF7L2蛋白如何直接降低胰島素的分泌機(jī)制目前還不明確。而且，糖尿病是一種多基因遺傳病,多個微效基因的累加作用及環(huán)境因素造成攜帶致病基因個體對糖尿病的遺傳易感性,其中單個基因的突變對疾病的發(fā)生起很小的作用，需綜合考慮整體因素的影響。

本研究納入398例腎移植患者，樣本量相對較小，而且基本是湖北漢族人，中國地域遼闊、民族眾多，其他地區(qū)和民族的TCF7L2rs290487多態(tài)性是否與PTDM相關(guān)還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

1 Grant SF,Thorleifsson G,Reynisdottir I,et al.Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.Nat Genet,2006,38(3):320-323.

2 T?njes A,Stumvoll M.The role of the Pro12Ala polymorphism in peroxisome proliferator- activated receptor gamma in diabetes risk.Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2007,10(4):410- 414.

3 Van Dam RM,Hoebee B,Seidell JC,et al.Common variants in the ATP sensitive K+channel genes KCN(Kir6.2)and ABCC8(SUR1) in relation to glucose intolerance：population- based studies and meta- analysis.Diabet Med,2005,22(5):590- 598.

4 Kang ES,Kim MS,Kim YS,et al.A Variant of the Transcription Factor 7-Like 2 (TCF7L2) Gene and the Risk of Posttransplantation Diabetes Mellitus in Renal Allograft Recipients.Diabetes Care,2008,31(1):63-68.

5 Ghisdal L,Baron C,Le Meur Y,et al.TCF7L2 polymorphism associates with new-onset diabetes after transplantation.J Am Soc Nephrol,2009,20(11):2459-2467.

6 Chang YC,Chang TJ,Jiang YD,et al.Association study of the genetic polymorphisms of the transcription factor 7-like 2(TCF7L2) gene and type 2 diabetes in the Chinese population.Diabetes,2007,56(10):2631-2637.

7 Helgason A,Pálsson S,Thoreifsson G,et al.Refining the impact of TCF7L2 gene variants on type 2 diabetes and adaptive evolution.Nat Genet,2007,39(2):218- 225.

8 Ren Q,Han XY,Wang F,et al.Exon sequencing and association analysis of polymorphisms in TCF7L2 with type 2 diabetes in a Chinese population.Diabetologia,2008,51(7):1146-1152.

9 Yu AR,Xin HW,Wu XC,et al.Adiponectin gene polymorphisms are associated with posttransplantation diabetes mellitus in Chinese renal allograft recipients.Transplant Proc,2011,43(5):1607-1611.

10 Le Bacquer O,Shu L,Marchand M,et al.TCF7L2 splice variants have distinct effects on beta-cell turnover and function.Hum Mol Genet,2011,20(10):1906-1915.

11 Yan Y,North KE,Ballantyne CM,et al.Transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) polymorphism and context-specific risk of type 2 diabetes in African American and Caucasian adults:The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study.Diabetes,2009,58(1):285-289.

12 Alsmadi O,Al-Rubeaan K,Mohamed G,et al.Weak or no association of TCF7L2 variants with type 2 diabetes risk in an Arab population.BMC Med Genet,2008,9:72.

13 Peng S,Zhu Y,Lü B,et al.TCF7L2 gene polymorphisms and type 2 diabetes risk:a comprehensive and updated meta-analysis involving 121174 subjects.Mutagenesis,2013,28(1):25-37.

14 Zhang BC,Li WM,Zhu MY,et al.Association of TCF7L2 gene polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in Han Chinese population:a meta-analysis.Gene,2013,512(1):76-81.

15 紀(jì)紅梅,劉 巍,邊 澈,等.TCF7L2 基因rs290487多態(tài)性與遼寧地區(qū)2型糖尿病發(fā)病的相關(guān)性.中國生物制品學(xué)雜志,2012,25(6):740-742.

16 張 勇,榮海欽,王 輝,等.TCF7L2基因rs290487多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)研究.實(shí)用糖尿病雜志,2009,5(3):27-29.

17 朱 暉,王佑民,許 敏,等.生物芯片快速檢測糖尿病風(fēng)險基因TCF7L2 rs290487位點(diǎn).安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,46(1):20-23.

18 Qiao H,Zhang X,Zhao X,et al.Genetic variants of TCF7L2 are associated with type 2 diabetes in a northeastern Chinese population.Gene,2012,495(2):115-119.

19 Ip W,Shao W,Chiang YT,et al.The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 is upregulated by insulin and represses hepatic gluconeogenesis.Am J Physiol Endocrinol Metab,2012,303(9):E1166-1176.

20 Jin T,Liu L.The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 and type 2 diabetes mellitus.Mol Endocrinol,2008,22(11):2383-2392.

21 Palmer ND,Lehtinen AB,Langefeld CD,et al.Association of TCF7L2 gene polymorphisms with reduced acute insulin response in Hispanic Americans.J Clin Endocrinol Metab,2008,93(1):304-309.

22 Savic D,Ye H,Aneas I,et al.Alterations in TCF7L2 expression define its role as a key regulator of glucose metabolism.Genome Res,2011,21(9):1417-1425.

23 Mondal AK,Das SK,Baldini G,et al.Genotype and tissue-specific effects on alternative splicing of the transcription factor 7-like 2 gene in humans.J Clin Endocrinol Metab,2010,95(3):1450-1457.