網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件下呋喃西林代謝物SEM在斑點叉尾鮰體內(nèi)組織分布及消除規(guī)律研究

劉永濤，艾曉輝，索紋紋，余少梅，陳建武

(1．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，湖北武漢430223;2．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水研究中心，江蘇無錫214081;3．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢430070)

呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)屬硝基呋喃類抗菌藥物，由于其在防治畜禽和水產(chǎn)動物的細菌和真菌等引起的疾病方面有較好效果曾被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中．呋喃西林進入動物體內(nèi)后被迅速代謝，主要代謝物為氨基脲(semicarbazide，SEM)．呋喃西林及其代謝物SEM具有致癌、致突變作用［1－3］，歐盟、日本和我國已禁止其使用［4］，但由于呋喃西林價格便宜、療效好，仍有養(yǎng)殖單位在使用該藥．呋喃西林代謝物SEM在動物體內(nèi)可與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，殘留期較長，因此，目前對于動物體內(nèi)呋喃西林使用的監(jiān)管主要是通過檢測其代謝物SEM．目前，關(guān)于呋喃西林代謝物SEM在水產(chǎn)動物體內(nèi)代謝與殘留的報道較少，僅有關(guān)于大菱鲆［4］、中華絨螯蟹［5］、螯蝦［6］等的報道．斑點叉尾鮰(Ietalurus punetaus)是我國從美國引進的淡水養(yǎng)殖品種，在我國大量養(yǎng)殖，并且每年出口量較大．目前，呋喃西林代謝物SEM在斑點叉尾鮰體內(nèi)分布及消除規(guī)律的研究還未見報道．本研究首次以斑點叉尾鮰苗種為研究對象，探索呋喃西林代謝物SEM在斑點叉尾鮰各組織中的分布與消除規(guī)律，為加強該藥物管理和監(jiān)督非法使用提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗動物 健康斑點叉尾鮰由湖北省仙桃市水產(chǎn)局提供，平均質(zhì)量為(92．7±24．6)g．試驗前在池塘的網(wǎng)箱(1 m×2 m×1．5 m)內(nèi)暫養(yǎng)一周．試驗池長37．1 m，寬18 m，平均水深1．1 m．試驗期間(2011年5月23日至2011年8月20日)每天上午8點和下午18點投喂斑點叉尾鮰飼料，并記錄水溫．試驗期間平均水溫為28℃，池塘水體pH 7．5－8．0．試驗結(jié)束時，斑點叉尾鮰的體重為(186±45．3)g．

1．1．2 儀器設(shè)備 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(SURYEYOR MS PUMP PLUS，SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS，Thermo TSQ QUANTUM ACESS MAX，Thermo LCquan 2．6數(shù)據(jù)采集處理軟件);自動高速冷凍離心機(HITACHI 20PR-520，日本);Mettler-TOLEDO AE-240型精密電子天平(梅特勒—托利多公司);FS-1高速勻漿機(華普達教學(xué)儀器有限公司);調(diào)速混勻器(上?？等A生化儀器制造廠);氮吹儀(AOSHENG，杭州奧盛儀器有限公司)．

1．1．3 藥品和試劑 呋喃西林代謝物氨基脲(SEM)標(biāo)準(zhǔn)品(純度 ＞93．5%，Dr．Ehrenstorfer GmbH);SEM-13C15-N2標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%，德國wegita)，呋喃西林原粉(純度＞90．1%，濟南金達藥化有限公司);甲醇(色譜純，美國J．T．Baker);LC-MS water(美國，CNW);乙酸銨(分析純，美國J．T．Baker)，二硝基苯甲醛(分析純，北京恒業(yè)中遠化工有限公司)．

1．2 方法

1．2．1 色譜分析條件 色譜柱:Hypersil Gold C18(100 mm ×2．1 mm ×3 μm)反相色譜柱;柱溫:30℃;流速 0．2 mL·min－1;進樣量 20．0 μL．梯度洗脫條件(表1):A相為甲醇，B相為5 mmol·L－1乙酸銨溶液．

1．2．2 質(zhì)譜分析條件 離子化模式:加熱大氣壓電噴霧離子源(HESI)，正離子模式;檢測方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式;噴霧電壓:3000 V;源內(nèi)解離電壓0 V;鞘氣壓力40 arb;輔助氣壓力20 arb;碰撞氣及壓力:氬氣，1．5 m Torr;離子傳輸毛細管溫度:350 ℃;Q1 PW 0．7，Q3 PW 0．7 ．母離子、定性離子對、定量離子對和碰撞能量見表2．

1．2．3 試驗設(shè)計與采樣 藥液的配制:稱取1．8 g呋喃西林原粉，溶于90 L水中，配制成20 mg·L－1呋喃西林溶液，置于125 L塑料箱中．

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 The mobile phase gradient elution program

表2 呋喃西林代謝物及其同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜條件1)Table 2 Spectometric parameters of SEM and SEM-13C15-N2

斑點叉尾鮰下塘前，采用 20 mg·L－1呋喃西林浸泡 15 min，于給藥后 0．25、0．5、1．0、2．0、4．0、6．0、8．0、12、24、48、96、192、288、384、480、720、1080、1440、2160、2880 h 尾靜脈取血液、肌肉、皮膚、肝臟和腎臟等組織，置－20℃冰箱避光保存，待測定．每個時間點各取5尾魚，作為5個平行樣品分別處理測定．對照組為不用呋喃西林浸泡，養(yǎng)殖在同一池塘的不同網(wǎng)箱中的斑點叉尾鮰，定期采集樣品進行分析．

1．2．4 樣品前處理 血液、肌肉、肝臟、腎臟和皮膚樣品的處理，按照參考文獻［7］進行，略有改動．將冷凍保存的血液、肌肉、皮膚、肝臟和腎臟樣品室溫下自然解凍，取血液1 mL，皮膚1．0 g，肌肉2．0 g，肝臟和腎臟根據(jù)樣品量稱取并記錄稱取量，其余按照標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行．

1．2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及回收率與精密度測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:配制含SEM濃度為1、2、5、10、20 ng·mL－1，含5 ng·mL－1內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，配制含 SEM 濃度為 50、100、200、500、1000 ng·mL－1，含5 ng·mL－1內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，作HPLC/MS/MS分析，以測得的SEM與SEM-13C15-N2面積的比值X為橫坐標(biāo)，SEM濃度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)．用空白組織制成低質(zhì)量濃度藥物的含藥組織，經(jīng)預(yù)處理后測定，將引起3倍基線噪音的藥物的質(zhì)量濃度定義為最低檢測限．

回收率與精密度測定:回收率/%=Cr/C0×100，其中Cr為用空白血液、肌肉肝臟、皮膚、腎臟組織中加入一定量的SEM已知標(biāo)準(zhǔn)溶液，再按樣品預(yù)處理方法進樣后，測定SEM的質(zhì)量濃度;C0為加入一定量的SEM已知標(biāo)準(zhǔn)溶液．在5種空白組織中分別添加4個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使組織中質(zhì)量濃度分別為1．0、20．0、50．0 和 200．0 μg·kg－1，血液為 1．0、10．0、50．0、100．0 和 200．0 μg·L－1．每個濃度的樣品，日內(nèi)做5個重復(fù)，一周內(nèi)重復(fù)做5次，計算日內(nèi)及日間精密度．

1．2．6 數(shù)據(jù)處理 標(biāo)準(zhǔn)曲線，藥物經(jīng)時曲線圖，消除方程及休藥期計算和回歸圖，采用Microsoft Excel 2003，進行計算和繪制．消除方程采用C=C0×e－kt，C表示藥物濃度，C0為殘留消除對數(shù)曲線的截距(μg·kg－1)，k表示消除速率常數(shù)．

2 結(jié)果與分析

2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)

在1．0 －20．0 ng·mL－1和50．0 －1000．0 ng·mL－1范圍內(nèi)，SEM 線性關(guān)系良好，低濃度線性方程為 Y=0．0234054+0．130627X;高濃度線性方程為 Y=0．0801631+1．3252417X ，相關(guān)指數(shù)均大于 R2=0．9988．

2．2 方法檢測限、回收率與精密度

本試驗條件下，血液中SEM方法檢測限為0．5 μg·L－1，肌肉、肝臟、腎臟和皮膚組織中SEM方法檢測限均為0．5 μg·kg－1．各組織中5個質(zhì)量濃度加標(biāo)水平的SEM平均回收率為96．32% －108．65%，測得的日內(nèi)精密度與日間精密度均小于10%．

2．3 SEM在斑點叉尾鮰血液中的濃度

將測到的SEM的峰面積分別與其氘代同位素內(nèi)標(biāo)峰面的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以求出SEM在斑點叉尾鮰血液中的濃度(表3)．由表3可以看出，SEM峰濃度分別出現(xiàn)在1 h，濃度為(37．5±7．45)ng·mL－1，1440 h(60 d)的濃度為(0．57 ±0．25)ng·mL－1，2160 和2880 h 時，均未檢測到 SEM．

表3 呋喃西林(20 mg·L－1)浸泡后SEM在斑點叉尾鮰血液中的濃度1)Table 3 The concentrations of SEM in channel catfish blood after 20 mg·L－1nitrofuranzone bath

2．4 SEM 在斑點叉尾鮰組織中分布和消除規(guī)律

由表4 可知，2 h 時，SEM 在斑點叉尾鮰肌肉中達到峰值(33．3 ±8．25)μg·kg－1，480 h(20 d)的濃度為(1．17 ±0．80)μg·kg－1，1440 h(60 d)的濃度為(0．28 ±0．03)μg·kg－1，90 d 的肌肉中未檢出 SEM．SEM在斑點叉尾鮰皮膚中 2 h達到峰濃度(168．20 ±43．47)μg·kg－1，1080 h(45 d)的濃度為(8．75 ±0．52)μg·kg－1，1440 h(60 d)的濃度為(0．83 ±0．24)μg·kg－1，90 d 時皮膚中未檢出 SEM．在斑點叉尾鮰肝臟中，SEM 在 2 h 達到峰濃度(105．00 ±48．40)μg·kg－1，1080 h(45 d)的濃度為(1．00±0．08)μg·kg－1，60 d 的肝臟中未檢出 SEM．斑點叉尾鮰腎臟中，SEM 在 1 h 達到峰濃度為(383．30 ±89．20)μg·kg－1，1080 h(45 d)的濃度為(5．47 ±1．26)μg·kg－1，60 d 時，腎臟中未檢出 SEM．

表4 呋喃西林(20 mg·L－1)浸泡后SEM在斑點叉尾鮰組織中的濃度1)Table 4 The concentrations of SEM in channel catfish tissues after 20 mg·L－1nitrofuranzone bath

在4種組織中，SEM的消除半衰期從大到小依次為:血液＞皮膚＞肌肉＞腎臟＞肝臟(表5)．

表5 SEM在斑點叉尾鮰各組織中消除曲線方程及相關(guān)指數(shù)Table 5 The equation of elimination curve and correlation indexes of SEM in channel catfish after water bath of 20 mg·L－1nitrofuranzone

3 討論

目前，導(dǎo)致呋喃西林代謝物SEM在動物食品中的殘留原因，不僅與使用呋喃西林有關(guān)，還可能因為包裝和加工過程中其他污染造成［4］．而對于鮮活水產(chǎn)品而言，除甲殼類動物的甲殼和與甲殼相連的上皮層中自然產(chǎn)生的氨基脲［8］外，其它水產(chǎn)動物尚未有自身能產(chǎn)生氨基脲的報道．本研究對試驗環(huán)境如水體和底泥以及所用斑點叉尾鮰進行了本底篩查，均不含SEM．因此，SEM作為呋喃西林在斑點叉尾鮰體內(nèi)殘留的標(biāo)示物是可行的．本試驗采用生產(chǎn)實踐中所用的給藥方式和給藥劑量，并且在網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件下，探索呋喃西林代謝物SEM在斑點叉尾鮰各組織分布及其代謝規(guī)律，研究結(jié)果更接近于實際情況．

本研究表明，呋喃西林代謝物SEM在斑點叉尾鮰血液及其它組織中的起始濃度水平為:腎臟＞皮膚＞肝臟＞血液＞肌肉．譚志軍等［4］研究表明，在單藥給藥方式下，呋喃西林代謝物SEM在大菱鲆組織中的起始殘留濃度為:肝臟＞血液＞肌肉．蔣原等［6］研究SEM在克氏原螯蝦組織中的起始濃度為:鰓＞肝胰臟＞肌肉，SEM在水產(chǎn)動物肌肉組織中的殘留濃度較其它組織低．譚志軍等［4］采用呋喃西林藥浴質(zhì)量分數(shù)為20×10－12，每天靜水藥浴2次，上午和下午各1次，每次約3 h，共持續(xù)5 d，SEM在大菱鲆血液、肝臟和肌肉中最高累積濃度分別為 129．94、218．81 和 111．66 μg·kg－1;而本試驗采用 20 mg·L－1的呋喃西林浸泡斑點叉尾鮰15 min，SEM在血液和腎臟中最高累積濃度出現(xiàn)在1 h，濃度為(37．50±7．45)ng·mL－1;SEM在斑點叉尾鮰肌肉、皮膚和肝臟最高累積濃度均出現(xiàn)在 2 h，濃度分別為(33．30±8．25)、(168．20 ±43．47)和(105．00 ±48．4)μg·kg－1．因此，SEM 在這 2 種魚體內(nèi)的富集能力較弱，而各組織中SEM富集能力最差的是肌肉組織．480 h(20 d)時，肌肉中SEM濃度是其最小允許值1 μg·kg－1(歐盟2003年181號決議)的1．1倍，血液、皮膚、肝臟和腎臟中SEM在1080 h(45 d)時，分別是最小允許限1 μg·kg－1的1．17、8．75、1．0 和5．47 倍．在本試驗條件下90 d 后，SEM 在斑點叉尾鮰各組織中均未被檢出，而有研究表明SEM在大菱鲆體內(nèi)185 d后，仍有檢出且檢出值高于1 μg·kg－1，SEM在血液和各組織中消除半衰期為:血液(11．11 d)＞ 皮膚(9．02 d)＞肌肉(8．25 d)＞腎臟(7．40 d)＞ 肝臟(6．71 d)，而SEM 在大菱鲆肌肉、血液和肝臟組織中的半衰期分別為34．1、24．6和20．3 d，兩者差異較大，可能與魚體生理生化特性相關(guān)．整個實驗期間的平均水溫為28℃，在此養(yǎng)殖條件下，在斑點叉尾鮰苗種各組織中，消除SEM至少需要2520℃·d．

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