1株硫苷降解菌的分離鑒定

劉建利，陳 琛

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

菜籽粕是一種營養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)良飼料蛋白資源。但菜籽餅中的硫甙在動(dòng)物胃腸道內(nèi)發(fā)生分解后，會(huì)生成異硫氰酸酯(ITC)、惡唑烷硫酮(OZT)、腈等有毒物質(zhì)，限制了它在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[1]。為了降低菜籽粕的毒性，常用物理、化學(xué)和生物脫毒方法對其進(jìn)行脫毒，物理、化學(xué)脫毒方法脫毒率低，脫毒范圍較小，且會(huì)影響菜籽粕的適口性，另對植酸、單寧及芥子堿的脫除率較低，所以脫毒效果并不理想。生物脫毒法中微生物脫毒相對于其它方法具有成本低、條件溫和、干物質(zhì)損失小、硫甙降解徹底、脫毒效果好且能提高菜籽粕中蛋白質(zhì)的含量和品質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)[2]。國內(nèi)已有學(xué)者對菜籽粕的微生物脫毒工藝、菌種等進(jìn)行了研究，但脫毒能力仍有待進(jìn)一步提高[3-8]。為此，本試驗(yàn)以菜籽粕為原料，分離篩選具有較高脫毒能力的菌株，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 土壤取自寧夏西馬銀三村小白菜菜地；鎮(zhèn)羧甲基纖維素鈉，氯化鈀(上海試劑一廠生產(chǎn))；真菌DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，引物、Taq酶、dNTP、T載體、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司，瓊脂糖、EB購自北京經(jīng)科公司。

粗硫苷培養(yǎng)基：取油菜籽粕200 g，粉碎成細(xì)末，加蒸餾水800 mL，煮沸30 min，用3層紗布過濾去渣，10 000 r·min-1離心10 min去沉淀，定容到1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.2主要儀器 紫外可見光分光光度計(jì)(755型，上海精科分析儀器有限公司生產(chǎn))，高速冷凍離心機(jī)(3K30型， 美國Sigma公司生產(chǎn))，搖床(HZ-9210K型，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠生產(chǎn))，電子天平(FA2104B，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))，電泳儀(DYY-21型，北京六一儀器廠生產(chǎn))，凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR型號，美國Bio-rad公司生產(chǎn))。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1富集培養(yǎng) 取15 cm表層土壤樣品，裝入無菌塑料取樣袋帶回實(shí)驗(yàn)室，電子天平稱取0.5 g，置于無菌研缽研碎，轉(zhuǎn)移至25 mL 粗硫苷液體培養(yǎng)基中，150 r·min-1，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2分離 將富集后的菌液用無菌水進(jìn)行不同梯度稀釋，取0.1 mL稀釋菌液涂布在粗硫苷固體培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃培養(yǎng)48 h；挑單菌落，劃線轉(zhuǎn)接至新的粗硫苷固體培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃培養(yǎng)48 h至菌落長出，重復(fù)劃線純化3次，根據(jù)菌落形態(tài)和顏色不同，將已純化的不同菌株最后接種至RSM固體培養(yǎng)基上于4 ℃冰箱保存。

1.3.3篩選 氯化鈀-硫苷降解率法，參考王寧惠[9]的方法并略作修改。

樣品準(zhǔn)備：將分離的菌株接種于10 mL 粗硫苷液體培養(yǎng)基中，150 r·min-1，28 ℃搖瓶培養(yǎng)96 h，將培養(yǎng)液于10 000 r·min-1離心10 min，取上清。

顯色：取0.5 mL上清液置于加入10 mL試管中，加入0.1%羧甲基纖維素鈉溶液2 mL，搖勻，再加入1 mL氯化鈀溶液顯色。以相同體積粗硫苷培養(yǎng)基替代上清液為對照。

比色：在24 ℃下放置1～2 h后，以0.5 mL蒸餾水、2 mL 0.1%羧甲基纖維素鈉溶液以及1 mL氯化鈀溶液混合液調(diào)零，于波長540 nm測OD值。

1.3.4真菌的形態(tài)鑒定 真菌載片培養(yǎng)[10]，根據(jù)培養(yǎng)菌落形態(tài)和載片培養(yǎng)觀察菌絲和孢子形態(tài)，根據(jù)《真菌鑒定手冊》初步鑒定[11]。

1.3.5DNA提取 將8號菌接種于粗硫苷固體平板上，培養(yǎng)5 d，刮取菌絲2 g，置于研缽中加液氮研磨后，提取步驟按照真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行，1%瓊脂糖，1×TAE電泳，EB染色檢測。

1.3.6ITS rDNA測序 引物：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系組成：10×PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP(各為10 mmol·L-1)0.5 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Ex Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，DNA模板1 μL，水補(bǔ)足使總體積為25 μL。PCR條件參考文獻(xiàn)[12]，擴(kuò)增產(chǎn)物于加入EB的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，連接T載體，藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測陽性克隆，序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.7系統(tǒng)發(fā)育分析 將序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，通過BLAST程序進(jìn)行比對。將所測序列及其近緣種序列Mega 5.0中NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，去掉支持率小于70%的分支。

2 結(jié)果與分析

2.1硫苷降解菌的分離篩選 獲得10株具有降解硫苷能力的菌株(表 1 )，粗硫苷降解率在44.69%～58.11%，平均為46.75%，其中8號菌株最高，可達(dá)58.11%。

2.28號菌株形態(tài)鑒定 在PDA培養(yǎng)基上8號菌株菌絲疏松，表面黃綠色，背面無色或略呈褐色(圖1)。在PDA培養(yǎng)基載玻片培養(yǎng)中可觀察到菌絲多分枝，具隔，產(chǎn)生大量長而粗糙的分生孢子梗，梗端頂端膨大成燒瓶形或球形的泡囊，在泡囊表面又生出呈放射狀排列的小梗(一般為雙層)，每個(gè)小梗頂端產(chǎn)生成串的表面粗糙的球形分生孢子，呈黃綠色(圖2)，初步判斷8號菌株屬于半知菌門(Deuteromycota)絲孢菌綱(Hyphomycetes)叢梗孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)曲霉屬(Aspergillus)黃曲霉(Aspergillusflavus)。

表1 部分菌株篩選結(jié)果Table 1 Part results of screening

圖1 8號菌株菌落Fig.1 Colony of strain No.8

圖2 8號菌株分生孢子梗及分生孢子Fig.2 Conidiophores and conidia of strain No.8

2.38號菌株的基因組DNA提取和 PCR擴(kuò)增ITS序列 8號菌株基因組DNA電泳結(jié)果(圖3)，大小約15 kb，呈帶狀。根據(jù)亮度判斷，濃度為300～400 ng·μL-1，可滿足PCR要求。采用基因組DNA 1 μL作為模板，用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增(圖4)，得到擴(kuò)增條帶，大小600～700 bp，與理論長度一致。

圖3 8號菌株的基因組DNA電泳結(jié)果Fig.3 Result of agarose gel-ectrophoresis of strain No.8 genomic DNA

圖4 PCR擴(kuò)增8號菌株ITS結(jié)果電泳圖Fig.4 Result of agarose gel-ectrophoresis of ITS PCR amplification of strain No.8

2.48號菌株的ITS序列分析 把所得到序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST比較，ITS序列與A.flavus同源性為99%。用MEGA5.0構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5),8號菌株和A.flavus菌株ATCC16883(AF138287)聚為一類，分子生物學(xué)證據(jù)也顯示8號菌株為黃曲霉(A.flavus)。

3 討論

菜籽粕脫毒是一個(gè)繁雜的過程，如果單純依靠物理或化學(xué)法脫毒往往效果不佳。而微生物種類多、生長迅速、培養(yǎng)成本低、代謝產(chǎn)酶系豐富，理論上幾乎能夠分解所有物質(zhì)。利用微生物對菜籽粕脫毒有以下幾個(gè)特點(diǎn)：第一，酶系豐富，產(chǎn)生分解硫甙的芥子酶多，能夠水解結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變的硫甙；第二，微生物能將硫苷徹底分解并轉(zhuǎn)化合成自身利用的物質(zhì)；第三，菜籽粕中難利用的營養(yǎng)因子如植酸、單寧、纖維素等，也能被同時(shí)分解，提高菜籽粕的綜合利用率；第四，微生物還可以產(chǎn)生香味物質(zhì)，可大大改善菜籽粕的適口性。因此，利用微生物脫毒，是當(dāng)前菜籽粕脫毒方法中較理想的方法[2]。

圖5 8號菌株的 ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain No.8

本研究篩選出一批具有硫苷降解能力的菌株，粗硫苷降解率在44.69%～58.11%，平均為46.75%，最高可達(dá)58.11%，單個(gè)菌株的降解能力高于已報(bào)道的[3-7]。有研究表明，硫苷是一大類物質(zhì)，基本結(jié)構(gòu)之外側(cè)鏈有不同，而降解硫苷的芥子酶也是一類結(jié)構(gòu)類似、功能相近的酶[13-15]。因此，針對不同菜籽粕中不同的硫苷種類及含量，采用不同結(jié)構(gòu)的芥子酶降解菌株可能會(huì)提高降解率，本研究分離的菌株為進(jìn)一步研究不同分解酶的結(jié)構(gòu)及其編碼基因奠定了基礎(chǔ)。

[1] 朱文優(yōu)，李華蘭，周守?cái)?菜籽粕脫毒方法及其特點(diǎn)[J].糧食與食品工業(yè)，2009，16(2)：6-8.

[2] 陳君.菜籽餅脫毒方法的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31(3)：33-34.

[3] 謝建坤，張強(qiáng)，李忠嫻，等.菜籽餅發(fā)酵菌株篩選研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1994，6(1)：75-81.

[4] 魏晶石，汪正華，沈儉.菜籽粕生物降解法脫毒及綜合利用[J].西部糧油科技，1999，24(6)：49-52.

[5] 蔣玉琴，李榮林，張玳華，等.復(fù)合菌脫毒菜籽餅粕及其應(yīng)用Ⅰ——不同處理?xiàng)l件下復(fù)合菌體系發(fā)酵對菜籽餅粕硫甙的降解[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，15(2)：104-106.

[6] 張宗舟.菜籽餅脫毒微生物的篩選、分離、純化與復(fù)配[J].甘肅科技縱橫，2005(3)：48-49.

[7] 劉軍，王娟娟.菜籽粕脫毒及提高蛋白質(zhì)含量菌株的篩選[J].飼料資源開發(fā)與利用，2007(10)：33-35.

[8] 孫林，李呂木，張邦輝，等.多菌種固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2009，24(1)：85-89.

[9] 王寧惠.油菜籽(餅粕)中硫苷葡萄糖苷總量速測方法——氯化鈀法[J].青海農(nóng)業(yè)科技，2009(3):58-59.

[10] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].第二版.北京：高等教育出版社，2006：26-32.

[11] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982：58-647.

[12] 岳海梅，張新軍，鞏文峰，等.林芝地區(qū)不同草地土壤微生物區(qū)系分析[J].草業(yè)科學(xué)，2012，29(7)：1019-1022.

[13] Sakorn P，Rakariyatham N，Niamsup H，etal.Rapid detection of myrosinase-producing fungi:A plate method based on opaque barium sulphate formation[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology,2002,18(1):73-74.

[14] Meulenbeld G H，Hartmans S．Thioglucosidase activity fromSphingobacteriumsp.strain OTG1[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2001,56(5-6):700-706.

[15] Zukalova H，Vasak J．The role and effects of glucosino-lates ofBrassicaspecies-A review[J]．Rostlinná Vroba,2002，48(4)：175-180.