野豌豆屬牧草種質(zhì)花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察

劉 鵬，馬利超，王 宇，劉志鵬

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

野豌豆屬(Vicia)牧草具有較高的營養(yǎng)價值和較強的抗寒特性，適宜在高寒和高海拔地區(qū)栽培，是高原牧區(qū)重要的蛋白飼料來源[1]。因其具有生物產(chǎn)量高、生育周期短、種子粗蛋白含量高[2]和抗寒性較強等特點[3]而被科技工作者廣泛關(guān)注。有報道顯示，蠶豆(V.faba)是我國最早栽培的豆類作物之一，可作飼料、綠肥和蜜源植物種植，其種子蛋白質(zhì)含量高達(dá)22.35%，是優(yōu)質(zhì)的植物粗蛋白源。山野豌豆(V.amoena)除作為優(yōu)良牧草及綠肥外，其種子還有一定的藥用價值。長柔毛野豌豆(V.villosa)種子中含有豐富的植物凝血素，這一物質(zhì)在免疫學(xué)、腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)的研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。箭筈豌豆(V.sativa)為一年生或越年生葉卷須半攀援性草本植物，整株可用作綠肥及飼料。對野豌豆屬植物的花粉生物學(xué)特性研究，可為植物物種及其種質(zhì)資源鑒定提供重要的形態(tài)依據(jù)。野豌豆屬植物約有190個物種[4]，Ball[5]將該屬劃分成4個組：Vicia，Cracca，Ervum和Faba。隨后研究人員進(jìn)一步分析了Vicia和Vicilla兩個亞屬的生物學(xué)特性[6-7]。此外，Vicia亞屬包括很多具有重要農(nóng)業(yè)價值的牧草[8]。Maxted[9]在原表型分類的基礎(chǔ)上又將Vicia亞屬細(xì)分為9大系列，38個物種，14個亞種。本屬植物主要分布在北半球溫帶地區(qū)，拉丁美洲有零星分布[10]。根據(jù)中國數(shù)字植物標(biāo)本館(http://www.cvh.org.cn/cms/)和宋敏等[11]的統(tǒng)計結(jié)果，在我國本屬植物廣布于全國各省，華北、西北和西南地區(qū)較多，其中栽培種5種，野生種36種，華南和臺灣地區(qū)分布很少，僅有野生種1種。

關(guān)于野豌豆屬植物花粉形態(tài)的研究，國內(nèi)學(xué)者曾開展過一些工作。蘇亞拉圖等[12]觀察了我國內(nèi)蒙古境內(nèi)13種野豌豆屬植物花粉掃描電鏡的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)野豌豆屬植物的花粉形態(tài)、萌發(fā)孔和外壁紋飾等特征在種內(nèi)是穩(wěn)定的。野豌豆屬新變種狹柳葉野豌豆(V.venosavar.ich-hsinganica)花粉形態(tài)為長球形，具三孔溝，溝緣加厚，孔膜高升，溝淺，外壁具不規(guī)則網(wǎng)狀紋飾[13]。Erdtman[14]認(rèn)為利用花粉粒形態(tài)特征可以提高植物分類的精確度。深入觀察花粉的形態(tài)特征可為植物分類學(xué)和授粉生物學(xué)等研究提供有價值的參考信息[15-16]。雖然很多學(xué)者在野豌豆屬植物花粉形態(tài)上做了一定的研究工作，但仍存在一些不足，如蘇亞拉圖[12-13]共觀察了13種內(nèi)蒙古野豌豆屬及其新變種植物的花粉形態(tài)，但13個物種全部來自中國內(nèi)蒙古，具有地域限制。本研究收集了中國、德國、埃塞俄比亞和蒙古的野豌豆屬花粉材料，使野豌豆屬孢粉學(xué)資料具有廣域性，更加完善。本研究利用高分辨率掃描電鏡，較為系統(tǒng)地對來自4個國家的8份野豌豆屬植物材料的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，獲取新材料的花粉形態(tài)學(xué)信息，探討其系統(tǒng)分類學(xué)特性，以期為野豌豆屬植物的孢粉學(xué)研究[17]積累相關(guān)信息。

1 材料和方法

1.1試驗材料 野豌豆屬植物種子由美國國家種質(zhì)資源庫(NPGS)和蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供。于2012年8月初播種于蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室(16 h光照，8 h黑暗；光照時22 ℃，黑暗時20 ℃)。在當(dāng)年10-11月盛花期分別采集成熟花藥作為掃描電鏡觀察的材料。材料具體名稱及來源地見表1。

1.2試驗方法

1.2.1花粉采集 植物盛花期進(jìn)行取樣，每個物種采集5朵鮮花，用鑷子將花藥取出，放入1.5 mL EP管中，常溫下干燥48 h后存放于4 ℃冰箱中。為了獲得自然真實的表面紋飾，采用自然散出的花粉掃描，個別材料的花粉是從刺破的成熟花藥中釋放得到的，掃描前均未經(jīng)任何試劑處理[18]。在導(dǎo)電膠上將花粉均勻散布，置于金屬載物臺上，用常規(guī)真空噴鍍法噴金90 s后，置于掃描電鏡(日本電子光學(xué)公司，JSM-5600LV)下觀察，選取有代表性的視野，分別進(jìn)行顯微拍攝。

1.2.2計算方法 每份材料隨機取30?；ǚ圻M(jìn)行測量和統(tǒng)計，取平均值表示變化幅度?；ǚ哿４笮∫詷O軸長乘以赤道軸長(P×E)來表示，其形狀以極軸長和赤道軸長的比值(P/E)來表示。花粉的表面紋飾形態(tài)特征參照Punt等[19]的描述，P/E為0.5～0.8是扁圓形，P/E為0.8～1.0是扁球形，P/E為1.0～1.1是長球形。

表1 8份野豌豆屬種質(zhì)名稱及其來源Table 1 Name and origin of eight Vicia accessions

2 結(jié)果

對8份野豌豆屬植物材料的花粉進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，野豌豆屬植物的花粉為單?；ǚ?，赤道面觀是扁球形的有5種(V.amoena、V.fabavar.faba、V.fabavar.minuta、V.sativa2560A和V.sativa2560B)、扁圓形的2種(V.sativa2505和V.sativa2556)和長球形的1種(V.villosa)(表2)。對花粉粒大小的比較發(fā)現(xiàn)，不同物種花粉粒大小差異比較明顯，V.amoena和V.sativa2556極軸長顯著大于其他材料(P<0.05)。V.sativa2556赤道軸長顯著大于其他材料(P<0.05)。此外，野豌豆屬植物花粉外壁表面紋飾可分為網(wǎng)狀紋飾(V.fabavar.faba、V.fabavar.minuta、V.villosa和V.sativa2505)、腦狀紋飾(V.sativa2556和V.sativa2560A)、片狀紋飾(V.sativa2560B)和穴狀紋飾(V.amoena)4種類型，其極面觀為三裂圓形。萌發(fā)孔溝接近兩極且寬窄不一。

2.1萌發(fā)孔形態(tài)特征 本研究所觀察的8份植物材料花粉具有下列幾種萌發(fā)孔特征：1)萌發(fā)溝細(xì)窄，溝中部有明顯凸起。如V.fabavar.faba(圖1 A～C)，V.sativa2560A(圖2 D～F)，V.villosa(圖3 D～F)，V.sativa2556(圖4 A～C)，V.fabavar.minuta(圖4 D～F)。2)萌發(fā)溝較寬，溝中部無凸起。如V.sativa2505(圖2 A～C)，V.sativa2560B(圖3 A～C)。3)萌發(fā)溝中部無凸起。如V.amoena(圖1 D～F)。

2.2外壁表面紋飾 所觀察的花粉外壁表面紋飾有以下4個類型：1)網(wǎng)狀紋飾。網(wǎng)紋較深，網(wǎng)眼大小不一，如V.fabavar.faba(圖1 A～C);網(wǎng)紋較淺，網(wǎng)眼細(xì)密，如V.fabavar.minuta(圖4 D～F);網(wǎng)紋較淺，網(wǎng)眼較大，如V.villosa(圖3 D～F)、V.sativa2505(圖2 A～C)。2)腦狀紋飾。紋飾較深，立體感強烈，如V.sativa2560A(圖2 D～F);紋飾較淺，如V.sativa2556(圖4 A～C)。3)穴狀紋飾。如V.amoena(圖1 D～F)。4)片狀紋飾。如V.sativa2560B(圖3 A～C)。

表2 8份野豌豆屬植物材料花粉形態(tài)學(xué)特征Table 2 Main characteristics of the pollen morphology in eight accessions of Vicia

圖1 V.faba var. faba(A～C)和V.amoena(D～F)花粉粒形態(tài)Fig.1 Pollen morphology of V.faba var. faba(A～C)and V.amoena(D～F)

V.fabavar.faba(圖1 A～C)極軸長25.5，赤道軸長33.0，P/E值為0.8。赤道面觀為扁球形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝細(xì)窄，溝中部有明顯凸起。表面為網(wǎng)狀紋飾，明顯，網(wǎng)眼大小不一。

V.amoena(圖1 D～F)極軸長30.0，赤道軸長37.6，P/E值為0.8。赤道面觀為扁球形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝細(xì)窄，少數(shù)花粉萌發(fā)溝中部有凸起。表面為穴狀紋飾，較深。

V.sativa2505(圖2 A～C)極軸長24.3，赤道軸長34.8，P/E值為0.7。赤道面觀為扁圓形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝較寬，溝中部有明顯突起。表面為網(wǎng)狀紋飾，較深，網(wǎng)眼大小不一。

V.sativa2560A(圖2 D～F)極軸長20.5，赤道軸長25.8，P/E值為0.8。赤道面觀為扁球形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝細(xì)窄，溝中部有明顯突起。表面為腦狀紋飾，較深，紋飾層次分明。

V.sativa2560B(圖3 A～C)極軸長21.8，赤道軸長25.6，P/E值為0.9。赤道面觀為扁球形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝深且寬。表面為片狀紋飾，非常明顯。

V.villosa(圖3 D～F)極軸長10.3，赤道軸長9.0，P/E值為1.1。赤道面觀為長球形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝細(xì)窄，溝中部有明顯凸起。表面為網(wǎng)狀紋飾，較淺，網(wǎng)眼大小不一。

V.sativa2556(圖4 A～C)極軸長30.5，赤道軸長47.4，P/E值為0.6。赤道面觀為扁圓形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝細(xì)窄，溝中部有細(xì)小凸起。表面為腦狀紋飾，比較明顯。

V.fabavar.minuta(圖4 D～F)極軸長19.3，赤道軸長20.8，P/E值為0.9。赤道面觀為扁球形，極面觀為三裂圓形。三孔萌發(fā)溝并延伸達(dá)兩極，萌發(fā)溝細(xì)窄，溝中部有明顯凸起。表面為網(wǎng)狀紋飾，比較模糊，網(wǎng)眼大小不一。

3 討論

蘇亞拉圖等[12]認(rèn)為，V.amoena花粉粒外壁為細(xì)網(wǎng)狀紋飾或模糊，萌發(fā)溝中部有疣狀凸起，而本研究觀察發(fā)現(xiàn)，此物種的花粉粒外壁為穴狀紋飾，萌發(fā)溝比較平滑(圖1 D～F)。這8種植物花粉粒形態(tài)特征從以下方面進(jìn)行識別和區(qū)分，即花粉的極軸長和赤道軸長，赤道面觀，外壁紋飾。

圖2 V.sativa 2505(A～C)和V.sativa 2560A(D～F)花粉粒形態(tài)Fig.2 Pollen morphology of V.sativa 2505(A～C)and V.sativa 2560A(D～F)

圖3 V.sativa 2560B(A～C)和V.villosa(D～F)花粉粒形態(tài)Fig.3 Pollen morphology of V.sativa 2560B(A～C)and V.villosa(D～F)

圖4 V.sativa 2556(A～C)和V.faba var.minuta(D～F)花粉粒形態(tài)Fig.4 Pollen morphology of V.sativa 2556(A～C)and V.faba var.minuta(D～F).

按照花粉粒極軸長將這8份種質(zhì)從大到小排序，即V.sativa2556，V.amoena，V.fabavar.faba，V.sativa2505，V.sativa2560B，V.sativa2560A，V.fabavar.minuta，V.villosa(表2);同樣，按照花粉粒赤道軸長可排為V.sativa2556，V.amoena，V.sativa2505，V.fabavar.faba，V.sativa2560A，V.sativa2560B，V.fabavar.minuta，V.villosa。表明，這8份種質(zhì)花粉粒的極軸長與赤道軸長沒有直接的相關(guān)性。根據(jù)花粉粒體積大小演化的一般趨勢，即比較原始的植物花粉粒體積較大[20]。因此，可以根據(jù)這8個物種花粉粒的極軸長和赤道軸長推測它們的歷史演化趨勢。

通過對野豌豆屬8種植物(1種已見報道)的花粉進(jìn)行掃描電鏡觀察，既對已報道的結(jié)果進(jìn)行驗證，又同時獲得了新材料的花粉形態(tài)學(xué)信息，對豐富野豌豆屬植物孢粉學(xué)的信息做出了一定貢獻(xiàn)。在已報道的V.amoena發(fā)現(xiàn)差異較大，本研究有明確的引種渠道和形態(tài)學(xué)分類結(jié)果，獲得了清晰的花粉粒掃描電鏡照片(圖1 D～F)；而前人僅在文中做了描述，并未提供圖片。從而表明，對植物孢粉學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)行驗證是必要的。

有研究資料表明，可將花粉形態(tài)特征作為植物的分類依據(jù)[21]。V.amoena極軸長與V.sativa2505和V.villosa差異顯著(P<0.05)，推測二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；V.fabavar.faba與V.sativa2556和V.villosa的花粉在赤道軸長上差異顯著，推測二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這一結(jié)果有關(guān)學(xué)者通過分子標(biāo)記已經(jīng)證實[22-23]?；ǚ圩鳛橹参锏谋Ｊ仄鞴?，其形態(tài)特征具有可遺傳性，同時具有科屬的共同特征和種的特異性[24]。張庭龍等[25]認(rèn)為花粉粒大小可能與植物生長環(huán)境有關(guān)，花粉形態(tài)要比花粉絕對大小更加穩(wěn)定。Beck[26]指出，植物花粉在原始時期都是光滑且具有無定型的外壁，可以推測原始的野豌豆屬植物花粉外壁都是光滑的，依據(jù)進(jìn)化程度的不同，外壁紋飾也有明顯差異，這為鑒定物種的特異性提供了依據(jù)[27]。長柔毛野豌豆外壁紋飾為網(wǎng)狀紋飾，較淺，推測其進(jìn)化上處于較原始的地位。V.sativa2560A和V.sativa2560B的外壁紋飾都非常明顯，推測其處于較為進(jìn)化的地位。此結(jié)果有關(guān)學(xué)者在野豌豆屬植物的核型研究上已經(jīng)得到證實[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)植物花粉形態(tài)和外壁紋飾類型，可鑒定野豌豆屬的共同特征和種的特異性。此外，還可根據(jù)花粉粒的極軸長、赤道軸長和萌發(fā)孔形態(tài)特征將這8份豌豆屬植物材料區(qū)分開來。此外，根據(jù)所研究的8份野豌豆屬植物材料花粉粒大小的演化趨勢還可推測各個材料的進(jìn)化程度甚至親緣關(guān)系，為野豌豆屬牧草系統(tǒng)分類學(xué)奠定基礎(chǔ)，為其孢粉學(xué)相關(guān)研究積累信息。

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