骨骼風(fēng)痛片中雞血藤高效液相特征圖譜研究

徐 建，徐 云，王 鑫，王婷婷，徐國強(qiáng)，白 冰

(吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，長春 130012)

骨骼風(fēng)痛片為修正藥業(yè)集團(tuán)通化通藥制藥股份有限公司生產(chǎn),由雞血藤、穿山甲、干姜3味藥制成，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)，散寒止痛的功效，用于風(fēng)濕痹痛等癥。雞血藤為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖，具有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)之功，用于月經(jīng)不調(diào)，血虛萎黃，麻木癱瘓，風(fēng)濕痹痛等癥[1]，是處方中的君藥。

中藥特征圖譜能全面、綜合的反映所含成分的相對關(guān)系，較好的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性，具有特征明顯、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點[2-5]。本研究通過HPLC方法建立方中雞血藤藥材特征圖譜，從而確定成品中雞血藤的特征圖譜。由于雞血藤在骨骼風(fēng)痛片中是以水提物入藥，決定以雞血藤水提物為基礎(chǔ)，研究雞血藤原藥材與成品骨骼風(fēng)痛片的相關(guān)性。

1 實驗材料

1.1 儀器 HITACHI高效液相色譜儀，紫外檢測器；Mettler AE240十萬分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；AB204-E電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)等。

1.2 試劑與試藥 不同來源的雞血藤藥材，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10分別產(chǎn)自廣西白色、廣西寧明、廣西柳州、廣西憑祥、廣西寧明、廣西玉林、廣西欽州、廣東德慶、廣東高要、云南等地。藥材經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定；骨骼風(fēng)痛片(批號:20120901)；乙酸乙酯、環(huán)己烷、磷酸、甲醇等為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]色譜柱GraceSmart RP 18 (5 μm,4.6 mm×250 mm) ；流動相：乙腈-0.1%磷酸(34∶66)；檢測波長：280 nm；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素10 mg，用甲醇溶解于50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為儲備液。取儲備液2 mL至10 mL容量瓶中混勻,甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取雞血藤藥材粗粉10 g，加水100 mL，100 ℃水浴回流提取2 h，趁熱過濾，濾液濃縮至20 mL，先用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，在水浴鍋上80 ℃蒸干，殘渣用水洗2次，每次10 mL，合并補(bǔ)足20 mL，再用環(huán)己烷萃取3次，每次20 mL，合并環(huán)己烷液，在水浴鍋上80 ℃蒸干，殘渣用甲醇洗滌2次，每次2 mL，定容至5 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 HPLC-UV特征圖譜方法學(xué)考查

2.4.1 精密度實驗 選擇S1號雞血藤藥材，按照2.3項下制備方法制備供試品,按2.1項下方法連續(xù)進(jìn)樣測量6次，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.12%～0.90%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實驗 取S1號雞血藤藥材，按照2.3項下制備方法制備供試品,按2.1項下方法連續(xù)進(jìn)樣測量供試品制備方法制備6分樣品,各共有峰的相對保留時間RSD為0.11%～0.72%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取S1號藥材，按照2.3項下制備方法制備供試品,按2.1項下方法在0,2，6，8，12 h分別進(jìn)樣檢測，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.13%～0.33%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 特征圖譜的建立與相似度評價[7-11]

2.5.1 特征圖譜的建立 按2.3項下的方法制備10批不同產(chǎn)地的雞血藤藥材HPLC特征圖譜供試品溶液。按2.1項下方法依次進(jìn)行檢測，獲得10批不同產(chǎn)地的雞血藤藥材HPLC特征圖譜和共有模式圖根據(jù)10批供試品溶液的測定結(jié)果，標(biāo)定共有特征峰6個,以3號共有峰(芒柄花素)作為參照峰，計算相對保留時間，見表1。

表1 雞血藤藥材6個共有峰的相對保留時間結(jié)果

2.5.2 相似度評價 用國家藥典委員會中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)軟件,對10批樣品進(jìn)行分析，自動生成雞血藤的對照特征圖譜，HPLC-UV特征圖譜與對照圖譜進(jìn)行比較，尋找共有峰并進(jìn)行相似度評價，見表2。

表2 雞血藤HPLC-UV特征圖譜相似度結(jié)果

結(jié)果:10批雞血藤藥材有相對保留時間RSD為0.34%～2.16%，表明相對保留時間穩(wěn)定。HPLC-UV特征圖譜的相似度均90%以上，可以認(rèn)定10批雞血藤藥材質(zhì)量相近。

3 骨骼風(fēng)痛片中雞血藤的特征圖譜研究

3.1 對照品溶液的制備

3.1.1 雞血藤藥材對照品溶液的制備 取雞血藤藥材10 g,精密稱定，粉碎后按2.3項下供試品制備方法制備，即得。

3.1.2 陰性對照品溶液的制備 按照骨骼風(fēng)痛片的工藝,制備缺少雞血藤藥材的陰性樣品。取樣品10 g，精密稱定，粉碎后按2.3項下供試品制備方法制備，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取骨骼風(fēng)痛片(批號：20120901)10 g，精密稱定，粉碎后按2.3項下供試品制備方法制備，即得。

3.3 特征峰的確定 為了確定雞血藤的相關(guān)成分在骨骼風(fēng)痛片圖譜中的體現(xiàn)，本實驗將芒柄花素對照品溶液、雞血藤藥材對照品溶液、陰性對照品溶液、骨骼風(fēng)痛片供試品溶液按特征圖譜建立的色譜條件分別進(jìn)樣并比較，確定雞血藤的特征峰。

取上述4種樣品分別注入高效液相色譜儀記錄色譜并比較,結(jié)果可以看出 2、3、6號共有峰為骨骼風(fēng)痛片中雞血藤的特征峰，其中3號峰為芒柄花素。

4 討論

從相對保留時間來看，該特征圖譜建立的方法可用于控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，同時通過考察雞血藤和骨骼風(fēng)痛片的相關(guān)性，將成品中3個特征峰歸屬為雞血藤藥材，并通過對照品，確定了其中的1個特征峰為芒柄花素。雞血藤藥材特征圖譜的建立及成品中雞血藤特征峰的確定可以為骨骼風(fēng)痛片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

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