免提取直接擴增技術(shù)在現(xiàn)場生物物證中的應(yīng)用

吳 婷牛青山潘永峰辛 陽

（1 中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035；2 沈陽市公安局刑警支隊 遼寧 沈陽 110002）

免提取直接擴增技術(shù)在現(xiàn)場生物物證中的應(yīng)用

吳 婷1牛青山1潘永峰2辛 陽1

（1 中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035；2 沈陽市公安局刑警支隊 遼寧 沈陽 110002）

通過采用Golden eye DNA ID System 20A試劑盒，對沈陽市局2013年第二季度實際案例中現(xiàn)場所提取到的生物檢材如血濾紙、血棉簽、血紗布、煙蒂、吸管、硬質(zhì)糖果等進行直接擴增檢驗，以探討DNA直接擴增檢驗技術(shù)對實際案例中常見現(xiàn)場檢材的有效性及可靠性。結(jié)果證明直接擴增檢驗技術(shù)能夠應(yīng)用于實際案例中常見現(xiàn)場檢材的檢測。

直接擴增法 Golden eye DNA ID System 20A 現(xiàn)場生物檢材

近年來，DNA鑒定以其特有的技術(shù)優(yōu)勢，在公安機關(guān)案件偵破及法庭科學(xué)證據(jù)系統(tǒng)中占有越來越重要的位置。常規(guī)法醫(yī)物證實驗室DNA檢驗過程涉及到DNA提取、定量、PCR擴增及電泳檢測等多個操作步驟，其中DNA提取過程就比較繁瑣，所以用常規(guī)方法完成DNA檢測過程需耗費大量的人力、物力、財力及時間。目前，DNA數(shù)據(jù)庫逐漸成為跨時空精確打擊犯罪的“刑偵利器”，因此，迫切需要擴大DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)的規(guī)模。這無疑對傳統(tǒng)的DNA檢驗方式方法及流程提出了新的要求。本實驗通過對實際案例中現(xiàn)場提取的檢材采用Golden eye DNA ID System 20A進行免DNA提取步驟的直接擴增研究，證明如果檢材沒有受到土壤等污染可以應(yīng)用直接擴增法進行DNA檢驗，并應(yīng)用于實際工作中。該技術(shù)的應(yīng)用可極大地降低檢測成本，加快檢測速度，提高實驗人員的工作效率。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

樣本為沈陽市局2013年第二季度日常DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)所積累。從中隨機抽取樣本包括血濾紙7例、血棉簽27例、血紗布3例、煙蒂6例、吸管1例、硬質(zhì)糖果1例。

1.2 主要儀器和試劑

Golden eye DNA ID System 20A試劑盒；微量移液器(Gilson)；96孔板；9700型PCR擴增儀(AB公司)；3130xl型遺傳分析儀(AB公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本分組樣本分組見表1。

1.3.2 加樣方法

先將預(yù)先配好的擴增試劑加入96孔板需要加樣本的凹內(nèi)。剪取不同樣本的檢材分別置于96孔板凹內(nèi)。同時，分別剪取A組（浸出液紅褐色）和B組（浸出液淡黃色）的血濾紙進行不同濃度浸出液對免提取直接擴增影響的觀察。取硬質(zhì)糖果半份放入潔凈提取盒置于冰箱冷凍30分鐘，后連盒取出，用20μl移液器吸取20μl預(yù)先配好的擴增試劑，在硬質(zhì)糖果表面反復(fù)淬吸，后將淬吸液加入96孔板凹內(nèi)。在擴增前用潔凈10μl槍頭將載體較大的棉絮，紗布分別挑出。等位基因標準分型物Ladder 2孔。

表1

1.3.3 擴增條件

使用Golden eye DNA ID System 20A試劑盒進行擴增，本實驗擴增體系為20μl：PCR反應(yīng)液(1×模板)；引物混合物(2×Primer，2×Mix)；去離子水（5×water)。進行28次循環(huán)。擴增程序為：95℃，5min，循環(huán)0次；94℃，30s，60℃，1min，70℃，1min，28次循環(huán)；60℃，30min，15℃，forever。其余操作過程按照試劑和儀器說明書進行。

2 結(jié)果

隨機抽取沈陽市局2013年第二季度日常DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)所積累樣本56份，分別為不同載體的血跡、唾液斑。對其進行直接擴增，結(jié)果見表2。對于以濾紙為載體的血跡樣本，A組浸出液為紅褐色，B組浸出液為淡黃色，此兩組對比結(jié)果見表3。

表2 不同載體上生物檢材DNA“直擴”檢測結(jié)果

表3 浸泡載體后PCR擴增液的顏色對DNA“直擴”的影響

3 討論

直接擴增的方法在動物、植物和微生物分子生物學(xué)中應(yīng)用較廣。該技術(shù)快速、準確、穩(wěn)定，非常適用于DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)，還有利于提高基層公安機關(guān)應(yīng)對一些大規(guī)模災(zāi)難性事故、群體性突發(fā)事件中DNA樣本檢驗的能力。

首先，與傳統(tǒng)常規(guī)方法相比，直接擴增技術(shù)具有如下優(yōu)點：最突出的是省略了DNA提取步驟，僅通過擴增和檢測兩個步驟即可獲得完整的STR分型結(jié)果，大大縮短了DNA檢驗的時間，同時也節(jié)約了提取試劑和相關(guān)耗材；另外還避免了常規(guī)提取、擴增過程中轉(zhuǎn)移樣品或試劑可能造成的污染。

其次，通過本次試驗研究，直接擴增檢驗法雖然具有快速、簡便的特點，但該方法還有一定的局限性。該方法適用于現(xiàn)場檢材量大的DNA快速分析，對于微量和特殊檢材，建議不采用該方法進行檢驗。一般相對潔凈的室內(nèi)現(xiàn)場血跡和唾液斑的提取“直擴”比室外露天泥土灰塵較多的樣本成功率更高。例如以棉簽為載體的現(xiàn)場血跡沒能成功的幾個樣本均為室外泥沙磚石上轉(zhuǎn)移下來的血跡，為相對不潔凈的樣本，所含的泥沙等雜質(zhì)相對過多而抑制直接擴增。另外，本實驗中的吸管這一樣本就沒有檢測成功，分析原因可能是由于彩色塑料制品，長時間浸泡在擴增液中進行直接擴增，這其中有可能出現(xiàn)了抑制PCR反應(yīng)的化學(xué)成分。

最后，就本次試驗提出幾點經(jīng)驗，第一，檢材量應(yīng)與擴增體系相適應(yīng)，血痕的浸泡液以淡黃或淡紅色為宜。本次研究中，如結(jié)果所示：擴增28個循環(huán)的1-7號濾紙血樣中沒有取得成功的1-4號樣本，均是由于檢材量過大，經(jīng)浸泡后擴增液呈紅褐色，雖然樣本中DNA的濃度相對增加了，而抑制PCR反應(yīng)的血紅蛋白等物質(zhì)的含量也同樣增加，最終導(dǎo)致試驗檢測結(jié)果不理想；第二，在擴增前用潔凈10μl槍頭將載體較大的棉絮，紗布分別挑出，能獲得更好的檢測效果；第三，先加擴增液再逐個加入待檢樣本，這樣能減少鄰近樣本的污染；第四，電泳前加樣應(yīng)小心操作，切不可吸入檢樣載體，以免堵塞電泳儀毛細管。參考文獻

1.趙興春，葉健.法庭DNA技術(shù)的發(fā)展及展望[J].刑事技術(shù)，1998，（5）

2.張建，姜成濤，趙興春，等.DNATyperTM15試劑盒直接擴增檢驗紙質(zhì)樣本的研究[J].刑事技術(shù)，2011，（4）

3.胡蘭，陳松，張國臣.國家法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)勢在必行[J].刑事技術(shù)，2003，（6）

4.李鈞敏，金則新.一種高效可直接用于PCR分析的土壤總微生物DNA抽提方法[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006，17（11）