復(fù)方血栓通膠囊中4個(gè)有效成分的一測多評定量方法研究*

梁潔萍，陳 思，謝稱石，彭 維，蘇薇薇 (．中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 5075；．廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，廣東 東莞 5335)

中藥復(fù)方血栓通膠囊具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰的功效，用于治療血瘀兼氣陰兩虛證的視網(wǎng)膜靜脈阻塞。現(xiàn)代藥理研究[1-3]以及本實(shí)驗(yàn)室[4]前期研究表明：三七皂苷類化合物(主要為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1)是復(fù)方血栓通膠囊發(fā)揮活血化瘀藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。這種多成分、多功效的特點(diǎn)意味著控制單一成分難以全面控制其質(zhì)量，需建立簡便易行的多成分同步質(zhì)量控制模式。為此，王智民等[5]提出了“一測多評”法，即利用中藥有效成分間的相關(guān)關(guān)系，只測定一個(gè)成分，來實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測定，近年來已有不少關(guān)于這方面的研究[6-8]。復(fù)方血栓通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2010版一部[9]，“含量測定”項(xiàng)以高效液相色譜外標(biāo)法測定了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，外標(biāo)法雖具有準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，但必須有足夠量、高純度的化學(xué)對照品，應(yīng)用中成本較高、方法較復(fù)雜。本研究建立的一測多評法，只需人參皂苷Rg1對照品即可同時(shí)測定復(fù)方血栓通膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb14 個(gè)有效成分的含量，具有準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

10萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司，BP211D型)；超純水器(美國密理博Millipore公司，Simplicity)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Laborota公司，4001型)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，KQ-250DE型)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(美國Dionex公司，DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機(jī)、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC3000-RS柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon6.8數(shù)據(jù)處理軟件)；P680 高效液相色譜儀(美國Dionex公司，ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、ATH-585柱溫箱、P680四元梯度泵、Ultimate 3000 DAD檢測器)。

三七皂苷R1(批號：110745-200617)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201027)、人參皂苷Rb1(批號：110704-200921)、人參皂苷Re(批號：110754-200822)均購自中國藥品生物制品檢定所；10 批復(fù)方血栓通膠囊由廣東眾生藥業(yè)股份有限公司提供。

乙腈(美國 Burdick & Jackson) 為色譜純；甲醇(廣東光華化學(xué)廠有限公司) 為分析純、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、甲酸(瑞士 Fluka Analytical)為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Dionex Acclaim?120 C18(3 μm，150 mm×4.6 mm)為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，以w=0.05 %磷酸溶液為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫程序

0～60 min：A(15%→38%)；檢測波長為203 nm；柱溫25 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按三七皂苷R1計(jì)不低于10 000?；旌蠈φ掌芳皹悠飞V圖見圖1。

圖1 復(fù)方血栓通的對照品(A)及樣品(B)HPLC圖1:三七皂苷R1；2:人參皂苷Rg1；3:人參皂苷Re；4:人參皂苷Rb1Fig.1 HPLC of the samples of four mixed reference substances (A)and Compound Xueshuantong capsule(B)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品適量，置同一容量瓶中，加φ=50%甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.982 mg、人參皂苷Rb10.918 mg的混合對照品溶液；精密稱取三七皂苷R1對照品、人參皂苷Re對照品適量，加φ=50%甲醇分別制成每1 mL含三七皂苷R10.984 mg、人參皂苷Re 0.904 mg的對照品溶液；精密量取上述人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1混合對照品溶液5 mL，分別精密量取上述三七皂苷R1、人參皂苷Re對照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加φ=50%甲醇至刻度，混勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中加入φ=70%甲醇20 mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，將濾紙及濾渣置同一錐形瓶中，再加入甲醇20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，合并兩次濾液，減壓旋蒸至近干，φ=50%甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，加φ=50%甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，含量(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見表1，各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性良好。

表1 復(fù)方血栓通膠囊中4個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 校正因子計(jì)算

以人參皂苷Rg1為內(nèi)標(biāo)，按一測多評法建立的技術(shù)指南[10]中公式(1)，分別計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方血栓通膠囊中3種成分的相對校正因子Table 2 RCFs of three components in Compound Xueshuantong capsule

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD%分別為0.60%、0.4 %、1.00%、1.77%。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于配置后0、2、4、6、8、10、12、24、48 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD%分別為1.05%、0.95%、0.90%、0.30%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方血栓通膠囊內(nèi)容物(批次：1110401)約0.5 g共6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb14個(gè)成分的含量并計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD%分別為0.75%、0.64%、0.74%、0.60%。

2.6.4 加樣回收率 取復(fù)方血栓通膠囊內(nèi)容物(批號：110401)約0.25 g 共6份，精密稱定，分別按各成分在復(fù)方中的含量，精密加入與膠囊中含量相當(dāng)?shù)母鲗φ掌啡芤哼m量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的加樣回收率分別為95.84%、100.71%、97.73%、95.75%，RSD%分別為0.52%、1.44%、3.02%、1.85%。

2.6.5 不同儀器及不同色譜柱考察 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液5、10、15 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，依據(jù)一測多評法建立的技術(shù)指南[10]中公式(1)分別計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的校正因子。試驗(yàn)分別考察了2種高效液相色譜儀和3種色譜柱，所得的相對校正因子及其相對標(biāo)準(zhǔn)差見表3，結(jié)果表明不同的儀器及不同的色譜柱所得的相對校正因子無顯著性差異。

2.7 待測組分色譜峰的定位

采用一測多評法建立的技術(shù)指南[10]中保留時(shí)間差(ΔtR)的定位方法：測定內(nèi)標(biāo)物以及其余待測成分的相對保留時(shí)間，計(jì)算出內(nèi)標(biāo)物與其余待測物的保留時(shí)間差，再根據(jù)峰形、紫外吸收光譜等信息，就能夠正確判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，各成分相對保留時(shí)間的RSD%≤5%，因此認(rèn)為利用ΔtR進(jìn)行峰定位是合理、可行的。

2.8 一測多評法與外標(biāo)法結(jié)果比較研究

分別精密吸取制備好的供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算復(fù)方血栓通膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見表5，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，對外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算得到的含量進(jìn)行比較，p>0.05，表明兩種方法所測得各成分含量不存在顯著性差異，由此說明一測多評法可用于復(fù)方血栓通膠囊的多成分質(zhì)量評價(jià)。

表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子

表4 不同儀器和色譜柱測得相對保留時(shí)間

表5 外標(biāo)法和一測多評法測定復(fù)方血栓通中4個(gè)成分含量的比較

3 討 論

本研究構(gòu)建了復(fù)方血栓通中4種有效成分一測多評的方法，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，一測多評法與外標(biāo)法所得結(jié)果之間無顯著性差異，說明本研究建立的以人參皂苷Rg1為參照對照品的一測多評法具有可行性，只需人參皂苷Rg1對照品，就可進(jìn)行4個(gè)成分同步測定，可替代外標(biāo)測定法用于復(fù)方血栓通膠囊的質(zhì)量分析。本研究建立的方法，重復(fù)性、加樣回收率好，與外標(biāo)法相比具有簡便、快速、檢測成本低等優(yōu)點(diǎn)，是適合中藥特點(diǎn)多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)的新方法，為更全面評價(jià)復(fù)方血栓通的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鐘毅敏, 于強(qiáng), 胡兆科．復(fù)方血栓通膠囊在眼科臨床中的應(yīng)用[J]．廣東醫(yī)學(xué), 2004, 25(5): 487-488.

[2] 李冠烈．三七的現(xiàn)代研究與進(jìn)展(二)[J]．世界中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 3(10): 687-691.

[3] 楊志剛, 陳阿琴, 俞頌東, 等．三七皂苷藥理作用研究進(jìn)展[J]．中國獸藥雜志,2005, 39( 1) : 33-37.

[4] 劉忠政, 梁潔萍, 聶怡初, 等．復(fù)方血栓通膠囊基于血液循環(huán)和凝血過程相關(guān)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2013, 52(2): 97-100.

[5] 王智民, 高慧敏, 付雪濤, 等．“一測多評”法中藥質(zhì)量評價(jià)模式方法學(xué)研究[J]．中國中藥雜志, 2006, 31(23) : 1925-1928.

[6] 匡艷輝, 朱晶晶, 王智民, 等．一測多評法測定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿含量[J]．中國藥學(xué)雜志, 2009, 44( 5) : 390- 394.

[7] 彭維, 王永剛, 蘇薇薇．HPLC 法同時(shí)測定田基黃4個(gè)黃酮類成分含量[J]．中藥材,2011,34(8) : 1229-1231.

[8] 張德培, 羅源生, 賀凡珍．酒大黃中5種蒽醌類成分一測多評方法的建立[J]．中藥材, 2012,35(4) : 588-590.

[9] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部[S]．2010年版．北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 909-910.

[10] 王智民, 錢忠直, 張啟偉, 等．一測多評法建立的技術(shù)指南[J]．中國中藥雜志,2011,36(6): 657-658.