羅氟司特對(duì)百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺、肝、腎組織損傷與纖維化的抑制作用*

陳 妍，賀利利，羅鈺龍，林 鋒，黃志強(qiáng)，彭 維，蘇薇薇，李沛波

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

百草枯(paraquat，PQ)，化學(xué)名稱為1,1-二甲基-4,4-聯(lián)吡啶二氯化物，是一種在歐美與亞洲廣泛應(yīng)用的除草劑[1]。PQ對(duì)人體與動(dòng)物均具有極強(qiáng)的毒性，目前臨床尚無(wú)有效的解毒藥物。近年來(lái)因誤食或自殺口服PQ造成人和動(dòng)物急性中毒與死亡的案例越來(lái)越多[2]。PQ攝入后能分布于哺乳動(dòng)物機(jī)體各組織，主要蓄積在肺、肝、腎等器官，而最終導(dǎo)致其氧化損傷與纖維化病變[3]。呼吸道中的氧氣會(huì)增加PQ誘導(dǎo)的活性氧自由基產(chǎn)生，加重氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肺損傷，從而造成肺泡塌陷、血管滲漏與纖維化病變。PQ中毒還能造成肝血管破壞與堵塞、肝細(xì)胞壞死以及腎小管破壞與腎小球壞死等病變[4]。

PQ誘導(dǎo)的纖維化是繼氧化應(yīng)激后在多種誘導(dǎo)因子如IL-13、TNF-α、TGF-β等誘導(dǎo)下的成纖維細(xì)胞活化及其對(duì)受損機(jī)體的異常修復(fù)。環(huán)氧合酶(COX-2)或前列腺素受體基因敲除的小鼠在百草枯與博來(lái)霉素的誘導(dǎo)下更易產(chǎn)生嚴(yán)重的肺纖維化，而環(huán)腺苷酸(cAMP)及其結(jié)構(gòu)類似物的含量上升均能顯著緩解氣道滴注博來(lái)霉素誘導(dǎo)的倉(cāng)鼠肺纖維化，表明cAMP在抑制纖維化發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[5-6]。

羅氟司特是一種磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)選擇性抑制劑，具有有效抑制cAMP水解，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的作用[7]。羅氟司特對(duì)臨床哮喘與慢性阻塞性肺病患者具有顯著療效[8-11]。結(jié)果表明：羅氟司特能顯著抑制中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶、金屬基質(zhì)蛋白酶、白三烯B4以及活性氧自由基的釋放；能顯著抑制嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞因子的分泌；還能顯著抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖以及氣道上皮細(xì)胞MUC5AC基因的表達(dá)。除此之外，羅氟司特還能夠顯著緩解煙熏7個(gè)月誘導(dǎo)的小鼠肺氣腫，減少卵白蛋白反復(fù)激發(fā)6周誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺間質(zhì)膠原沉積以及抑制慢性缺氧21天誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈平滑肌增生。

近期研究結(jié)果表明：羅氟司特能夠抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷以及肺纖維化，而且證實(shí)這種作用與提高cAMP含量，促進(jìn)前列腺素(PGE2)的合成相關(guān)[12]。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺、肝、腎組織纖維化模型，探索羅氟司特對(duì)百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺、肝、腎組織損傷與纖維化的抑制作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，24只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK(粵)2003-0002粵鑒證字2008A022。

1.2 試劑與材料

羅氟司特(Rof)；由海利來(lái)醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：20110519，純度(w)大于99%；百草枯(PQ)：sigma-Aldrich，貨號(hào)856117，純度(w)大于98%；地塞米松：廣東華南制藥廠，批號(hào)20110504。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組與造模

昆明種小鼠24只，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK(粵)2003-0002 粵鑒證字2008A022。小鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分成以下4組，每組6只：空白對(duì)照組、PQ組、PQ+地塞米松組5 mg/kg組(PQ+Dex)、PQ+羅氟司特5 mg/kg組(PQ+Rof)。

具體造模方法如下：除空白組小鼠外，其余各組小鼠分別在第1天時(shí)腹腔注射PQ 20 mg/kg造模。在造模過(guò)程中，除空白組小鼠外，其余各組小鼠每天灌胃給與各受試藥物或生理鹽水，每天給藥1次，共給藥21 d。

2.2 樣本收集與染色切片分析

造模結(jié)束后，各組小鼠分別腹腔注射w=3.5%水合氯醛麻醉，并通過(guò)摘眼球法放血處死小鼠，然后四肢仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，手術(shù)分離小鼠肺葉、肝臟與腎后分別浸泡于φ=10%中性福爾馬林溶液中進(jìn)行脫水，并經(jīng)石蠟固定后切成3～4 μm的切片做HE染色與Masson染色。切片使用Mirax Scan在400×視野下觀察組織損傷與纖維化程度等病理學(xué)變化，并通過(guò)雙盲法進(jìn)行半定量分析。

3 結(jié) 果

3.1 肺組織形態(tài)學(xué)變化

小鼠肺組織Masson染色切片結(jié)果見(jiàn)圖1。肺組織中氣道、血管以及肺泡的形態(tài)學(xué)變化主要從血管滲漏與基底膜纖維化、氣道基底膜纖維化、氣道上皮增生、肺泡塌陷與融合、肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與肺間質(zhì)纖維化等6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行雙盲法半定量評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。空白組小鼠肺組織氣道、血管與肺泡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完整，僅在血管與氣道基底膜側(cè)見(jiàn)到少量膠原纖維沉積(圖1a)。PQ組小鼠肺組織在氣道、血管與肺泡水平均發(fā)生了顯著的纖維化病變，主要體現(xiàn)在：①血管尤其是肺小靜脈發(fā)生了滲漏與基底膜纖維化;②氣道基底膜增厚以及纖維化;③氣道上皮增生與黏液分泌增加;④部分肺泡細(xì)胞發(fā)生塌陷與融合，使得單個(gè)肺泡表面積增大;⑤環(huán)氣道與血管周圍的肺泡內(nèi)有較嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與間質(zhì)纖維化(圖1b)。PQ+地塞米松組按每天5 mg/kg的劑量給予地塞米松21 d后，小鼠肺組織中氣道基底膜、血管基底膜以及肺泡間質(zhì)纖維化程度均有明顯改善，而肺泡塌陷、氣道上皮增厚與黏液分泌、以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)水平的改善并不明顯(圖1c)。PQ+羅氟司特按每天5 mg/kg的劑量給與羅氟司特21 d后，小鼠肺組織氣道、血管與肺泡形態(tài)學(xué)病變均發(fā)生了明顯改善，僅出現(xiàn)中度的環(huán)氣道與血管基底膜纖維化與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1d)。

圖1 小鼠肺組織Masson染色切片F(xiàn)ig.1 Lung tissues of mice stained by Masson (T：氣道；V：血管；A：肺泡；1：血管基底膜纖維化；2：氣道基底膜纖維化；3：氣道上皮增生；4：肺泡塌陷與融合；5：炎性細(xì)胞浸潤(rùn))

評(píng)價(jià)指標(biāo)ConPQPQ+DexPQ+Rof血管滲漏與基底膜纖維化-/+++/++++/+++氣道基底膜纖維化-/++++++氣道上皮增生-++/++++++/++肺泡塌陷與融合-++/+++++-/+血管壁破壞與炎性浸潤(rùn)-+++++/++++/++肺間質(zhì)纖維化-+++/++-/+總評(píng)分11551056

1) -表示無(wú)(0分)，+表示輕度(1分)，++表示中度(2分)，+++表示重度(3分)

3.2 肝組織形態(tài)學(xué)變化

小鼠肝組織Masson染色切片結(jié)果見(jiàn)圖2。肝組織中血管與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化主要從肝間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管壁破壞與基底膜纖維化、肝間質(zhì)纖維化與肝細(xì)胞壞死等四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行雙盲法半定量評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。空白組小鼠肝組織血管與肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完整(圖2a)，PQ組小鼠肝中心靜脈以及小靜脈顯示出嚴(yán)重的血管壁破壞、血液堵塞以及基底膜纖維化，大量血液與炎性細(xì)胞滲出到肝組織中，肝間質(zhì)出現(xiàn)明顯的膠原纖維沉積與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞發(fā)生壞死(圖2b)。PQ+地塞米松組按每天5 mg/kg的劑量給與地塞米松21 d后，PQ誘導(dǎo)的小鼠肝組織中血管壁滲漏、基底膜纖維化以及肝細(xì)胞壞死程度均有明顯改善，但與空白組小鼠相比，其肝組織與血管形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯變化(圖2c)。PQ+羅氟司特組按每天5 mg/kg的劑量給與羅氟司特21 d后，PQ誘導(dǎo)的小鼠肝組織中肝細(xì)胞與血管形態(tài)學(xué)病變均得到明顯恢復(fù)(圖2d)。

圖2 小鼠肝組織Masson染色切片F(xiàn)ig.2 Liver tissues of mice stained by Masson(H：肝細(xì)胞；V：血管；1：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2：血管基底膜纖維化；3：血管內(nèi)皮滲漏以及浸潤(rùn))

評(píng)價(jià)指標(biāo)ConPQPQ+DexPQ+Rof肝間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)-++/++++-/+血管壁破壞與基底膜纖維化-++/++++/+++肝間質(zhì)纖維化-+++-/+肺細(xì)胞壞死-++++總評(píng)分09453

1) -表示無(wú)(0分)，+表示輕度(1分)，++表示中度(2分)，+++表示重度(3分)

3.3 腎組織形態(tài)學(xué)變化

圖3 小鼠腎組織HE染色切片F(xiàn)ig.3 Kidney tissues of mice stained by H&E (G：腎小球；R：腎小管；V：血管；1：腎小管形態(tài)變化、2：腎小球形態(tài)變化、4：血液滲漏與炎性細(xì)胞浸潤(rùn))

小鼠腎組織HE與Masson染色切片結(jié)果見(jiàn)圖3與圖4。腎組織中腎小管、腎小球與血管的形態(tài)學(xué)變化主要從腎小管上皮壞死、腎小球壞死、腎組織間質(zhì)與血管基底膜纖維化、血液滲漏與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等五個(gè)指標(biāo)進(jìn)行雙盲法半定量評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表3?？瞻捉M小鼠腎組織腎小管、腎小球與血管等組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完整，僅有個(gè)別腎小管出現(xiàn)柱狀上皮胞質(zhì)空泡化與脫落癥狀(圖3a與4a)。PQ組小鼠腎組織中腎小管、腎小球與血管顯示出嚴(yán)重的破壞與壞死癥狀，主要表現(xiàn)為腎小管柱狀上皮大量胞質(zhì)空泡化與脫落、部分腎小球壞死與退化、腎血管壁破壞導(dǎo)致血液與大量炎性細(xì)胞滲漏、血管平滑肌增生與基底膜纖維化(圖3b與4b)。PQ+地塞米松組按每天5 mg/kg的劑量給與地塞米松21 d后，PQ誘導(dǎo)的小鼠腎組織中腎小管柱狀上皮壞死脫落以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均得到明顯改善，但血管基底膜的纖維化程度以及腎小球壞死的比例均沒(méi)有明顯作用，且其整個(gè)腎組織形態(tài)學(xué)特征，與空白組小鼠相比仍具有明顯差異(圖3c與4c)。PQ+羅氟司特按每天5 mg/kg的劑量給與羅氟司特21 d后，PQ誘導(dǎo)的小鼠組織中腎小球與腎小管壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與血管基底膜纖維化等形態(tài)學(xué)病變均得到明顯恢復(fù)，與空白組小鼠比較，僅腎小管柱狀上皮的壞死與脫落存在明顯差異(圖3d與4d)。

圖4 小鼠腎組織Masson染色切片F(xiàn)ig.4 Masson staining of kidney tissues(G：腎小球；R：腎小管；V：血管；1：腎小管形態(tài)變化、2：腎小球形態(tài)變化、3：腎組織間質(zhì)與血管基底膜纖維化4：血液滲漏與炎性細(xì)胞浸潤(rùn))

評(píng)價(jià)指標(biāo)ConPQPQ+DexPQ+Rof腎小管上皮細(xì)胞壞死-/+++/++++++/++腎小球壞死-+++-/+腎組織間質(zhì)纖維化-+++-/+血管基底膜纖維化-/+++/++++/++-/+血液滲漏與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)-/+++++總評(píng)分1511654

1) -表示無(wú)(0分)，+表示輕度(1分)，++表示中度(2分)，+++表示重度(3分)

4 討 論

本研究中，我們參照文獻(xiàn)[2]構(gòu)建了一個(gè)PQ誘導(dǎo)的小鼠慢性肺、肝、腎組織損傷與纖維化模型，并在此模型上成功復(fù)制了PQ中毒后人體肺、肝、腎等器官組織損傷以及纖維化的形態(tài)學(xué)變化。這些變化主要包括：①肺泡塌陷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及間質(zhì)纖維化，肺血管與氣道壁增厚以及基底膜纖維化；②肝血管壁破壞、血液堵塞以及基底膜纖維化，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死以及肝間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與膠原纖維沉積；③腎小管與腎小球壞死，腎血管壁破壞與基底膜纖維化，以及腎組織間質(zhì)炎性細(xì)胞滲漏與膠原纖維沉積。這些病理學(xué)特征與已有的文獻(xiàn)報(bào)道一致[3,11]。

有文獻(xiàn)表明，羅氟司特能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化以及膠原纖維合成，這與其提高胞漿內(nèi)cAMP含量進(jìn)而促進(jìn)PGE2的合成相關(guān)[13]。本研究首次通過(guò)PQ誘導(dǎo)的小鼠慢性組織損傷與纖維化模型，發(fā)現(xiàn)羅氟司特對(duì)PQ誘導(dǎo)的小鼠肺、肝、腎等器官的組織損傷與纖維化癥狀均有顯著改善。這為羅氟司特的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李光義, 鄧曉, 侯憲文, 等. 除草劑對(duì)飛機(jī)草化感作用的影響研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2009, 48 (3): 93-101.

[2] 邵陽(yáng), 楊期東. 百草枯致小鼠肺纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2009, 26(4): 305-307.

[3] AWADALLA E A. Efficacy of vitamin C against liver and kidney damage induced by paraquat toxicity [J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64(5): 431-434.

[4] ZHI Qiaoming, SUN Haichen, QIAN Xiaoming, et al. Edaravone, a novel antidote against lung injury and pulmonary fibrosis induced by paraquat [J]. International Immunopharmacology, 2011, 11(1): 96-102.

[5] BOZYK P D, MOORE B B. Prostaglandin E2 and the pathogenesis of pulmonary fibrosis [J]. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2011, 45(3): 445-452.

[6] LIU Xiaoqiu, OSTROM R S, INSEL P A. cAMP-elevating agents and adenylyl cyclase overexpression promote an antifibrotic phenotype in pulmonary fibroblasts [J]. American Journal of Physiology-cell Physiology, 2004, 286(5): C1089-C1099.

[7] BOSWELL-SMITH V, PAGE C P. Roflumilast: a phosphodiesterase-4 inhibitor for the treatment of respiratory disease [J]. Expert Opinion on Investigational Drugs, 2006, 15(9), 1105-1113.

[8] MAHER T M, EVANS I C, BOTTOMS S E, et al. Diminished prostaglandin E2 contributes to the apoptosis paradox in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2010, 182: 73-82.

[9] HUANG S K, WHITE E S, WETTLAUFER S H, et al. Prostaglandin E(2) induces fibroblast apoptosis by modulating multiple survival pathways [J]. Faseb Journal, 2009, 23: 4317-4326.

[10] BAUM B J, MOSS J, BREUL S D, et al. Effect of cyclic AMP on the intracellular degradation of newly synthesized collagen [J]. Journal of Biological Chemistry, 1980, 255: 2843-2847.

[11] KUMAR R K, HERBERT C, THOMAS P S, et al. Inhibition of inflammation and remodeling by roflumilast and dexamethasone in murine chronic asthma [J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2003, 307(1): 349-355.

[12] CORTIJO J, IRANZO A, MILARA X, et al. Roflumilast, a phosphodiesterase 4 inhibitor, alleviates bleomycin-induced lung injury [J]. British Journal of Pharmacology, 2009, 156(3): 534-544.

[13] TOGO S, LIU Xiangde, WANG Xingqi, et al. PDE4 inhibitors roflumilast and rolipram augment PGE2 inhibition of TGF-{beta}1-stimulated fibroblasts [J]. American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology, 2009, 296(6): L959-L969.